原发性肝细胞癌病人PBMCs中HBV X、P基因的整合

　　作者：王淑霞，闫志勇，王力秋，赵海燕，刘成玉，王斌 　(临沂市人民医院放疗科，山东 临沂 276003; 青岛大学医学院)

　　[摘要]目的 探讨外周血单个核细胞(PBMCs)中乙型肝炎病毒(HBV) X、 P基因整合与原发性肝细胞癌(HCC)的关系。方法 分离HBsAg阳性的40例原发性肝癌病人PBMCs，提取基因组DNA;分别设计HBV X基因、P基因PCR引物，检测HCC病人PBMCs 基因组中HBV的X基因和P基因的整合情况。结果 HCC病人X基因在PBMCs中的整合率为77.5% (31/40)，P基因整合率为15.0%(6/40)，二者差异有显著性( χ2 =31.43，P < 0.001 )。结论 PBMCs 中存在HBV X、 P基因的整合，X基因片段的整合及表达是HCC发生的主要因素。

　　[关键词] 癌，肝细胞;肝炎病毒，乙型;基因;病毒整合

　　INTEGRATION OF HBV X AND P GENES IN PBMCs IN PATIENTS WITH PRIMARY HEPATOCELLULAR CARCINOMA

　　WANG SHU-XIA ，YAN ZHI-YONG，WANG LI-QIU， et al

　　(Department of Radiotherapy， Linyi People's Hospital， Linyi 276003， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the relationship between primary liver cancer (PLC) and integration of HBV X gene and P gene in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in PLC patients. MethodsPrimers X1， X2 were designed for HBV X Gene and P1， P2 for P gene. Extracted DNA from isolated PBMCs in 40 PLC patients with HBsAg positive. PCR was used to determine the integration of HBV P and X gene. ResultsThe integration of X gene and P gene was 77.5% (31/40) and 15.0% (6/40) respectively. The difference was significant ( χ2 =31.43，P <0.001). ConclusionThe integration of HBV X and P ex-ists in peripheral blood mononuclear cells， and the expression of X gene plays a major role in the occurrence of primary liver cancer.

　　[KEY WORDS]carcinoma， hepatocellular; hepatitis virus， type B; genes; virus integration

　　乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝DNA病毒，主要侵犯肝脏，也可侵犯肝外组织，尤其是外周血单个核细胞(PBMCs)[1，2]。人体感染HBV后可导致病毒携带者、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、爆发性肝衰竭等不同临床类型，部分慢性乙型肝炎可发展为肝硬化，大约30%～40%的肝硬化病人最终可发展为肝细胞癌(HCC)。尽管HCC发生的分子生物学机制尚不十分明确，但已确定慢性乙型肝炎病毒感染为HCC的主要致病因素，HBV感染者发展为HCC的危险性是未感染者的100倍以上[3]。研究认为，HBV感染可能通过多种途径引起HCC发生，其中HBV DNA整合于肝细胞基因组是HCC发生的主要机制之一;此外，也有研究发现HBV基因可以整合于PBMCs中[ 4 ]。本文采用PCR检测PBMCs中HBV X、P基因的整合情况，以探讨它们与HCC的关系，现报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象临沂市人民医院2003～2004年住院确诊的HBsAg阳性的原发性HCC病人40例，男34例，女6例;年龄38～72岁，平均(56.3±7.3)岁。其中Ⅰ期3例，Ⅱ期15例，Ⅲ期22例。 5例HBsAg阴性的原发性HCC病人和5例HBsAg阴性的健康体检者作阴性对照和健康对照。

　　1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶均为Pro-mega 公司产品;无RNase的DNaseⅠ为Sigma公司产品;引物由上海生工公司合成。

　　1.3 PBMCs的分离和细胞中基因组DNA提取 所有研究对象均于早晨无菌抽取空腹静脉血 5 mL， 置于EDTA抗凝的无菌试管中，4 ℃保存运输，标本收集后4 h内使用低渗溶解红细胞法提取全血中PBMCs。使用Promega 公司的DNA 提取试剂盒提取1 mL全血PBMCs中的细胞基因组DNA。

　　1.4 引物设计 从GenBank获得多株HBV的P基因及X基因全序列，用DNAStar软件分析编码DNA多聚酶-逆转录酶P基因的高保守序列及包含DR2在内 的X基因序列，分别设计P、X基因的上、下游引物，序列见表1。

　　表1 P、X基因的上、下游引物序列(略)

　　1.5 PCR检测X、P基因在PBMCs基因组中的整合情况 以X1、X2及P1、P2为引物 ，以DNA为模板行PCR检测。总反应体系25 μL(模板 3 μL，10×buffer 2.5 μL，Mg2+2.5 μL，4×dNTP 2 μL，10×上下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，ddH2 O 10.6 μL);扩增条件:94 ℃ 变性5 min后，94 ℃ 45 s ，50 ℃ 45 s ，72 ℃ 1 min，共35个循环，然后72 ℃延伸5 min。

　　1.6 统计学处理 采用青岛大学医学院周晓斌等设计的PPMs 1.5软件进行 χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 PBMCs基因组中HBV X、P基因整合情况 HBV X基因整合阳性标本扩增产物长度约为222 bp(图1);HBV P基因整合阳性标本扩增产物长度约为379 bp(图2)，均与预测结果一致。

　　2.2 HCC病人PBMCs中HBV X、 P基因整合率 HCC病人PBMCs中X基因片段的整合率为77.5%(31/40)， P基因片段的整合率为15.0%(6/40)，差别有极显著意义( χ2 =31.43， P <0.001)。HCC的Ⅰ、Ⅱ期X基因整合率为72.2%(13/18)，P基因整合率为11.1%(2/18); Ⅲ期X基因整合率为81.8%(18/22)，P基因整合率为18.2%(4/22)， Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期比较，X、P基因整合率差别均无统计学意义( χ2 =0.117、0.032，P >0.05)。

　　3 讨论

　　肝细胞癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，病死率在恶性肿瘤中居第3位 [5]。与逆转录病毒相似，HBV整合于肝细胞是肝细胞发生恶变的基础，整合的HBV基因组可在不同的环节参与细胞的癌变，可能作用于癌变的起始或持续感染使肝细胞坏死和再生，促成细胞的癌变;又有可能干扰正常宿主基因的功能，使癌变进展。

　　图1 PBMCs基因组中整合的HBV X基因(略)

　　M为DL2000 DNA Marker; ①～③ HCC扩增产物; ④ 健康对照; ⑤ 阳性对照; ⑥ 阴性对照

　　图2 PBMCs基因组中整合的HBV P基因(略)

　　M为DL 2000 DNA Marker; ①、② HCC扩增产物; ③ 健康对照;④ 阳性对照; ⑤ 阴性对照

　　大量研究报道，在HCC组织中HBV DNA的整合率可高达80%以上，其中病毒的X基因片段是主要的整合片段，其次是X基因上游的S基因[ 5，6]。我们在实验中发现，HBV的X基因和P基因在HCC病人PBMCs中的整合率分别为77.5%和 15.0%， X基因片段的整合率显著高于P基因片段，这与肝内有关研究数据呈平行关系。HBV的基因片段在PBMCs中的整合，亦主要为HBV X基因片段。HBV X基因位于核苷酸1 372～1 834之间，是HBV DNA中最小的一个开放读码框架(ORF)， 编码HBxAg;X基因片段整合后作为病毒癌基因直接诱导HCC或通过编码的HBxAg反式激活细胞内的原癌基因或转录因子引起HCC发生[ 7 ]。X蛋白质本身并不具有DNA结合能力，但对病毒和细胞基因表达有转化调节作用，其反式激活的靶细胞基因有p53、IGF-Ⅱ、c-mys、c-fas、N-ras、ets-2以及Ha-ras等。X蛋白还通过蛋白-蛋白相互作用而作用于DNA结合蛋白质(转录因子)，直接或间接作用于基因启动子/增强子而发挥转活化功能。HBV侵入人体后，经过脱壳、cccDNA形成、转录、翻译成一系列蛋白质，在此过程中编码病毒DNA多聚酶-逆转录酶的P基因起重要作用， P基因的表达是病毒在体内复制的首要指标，大量病毒的复制可导致病毒基因广泛整合[8]，可进一步在PBMCs中研究HBV复制与整合的关系。已确定HBV基因组4个开放阅读框架中，编码病毒核壳蛋白的S基因完全重叠于P基因中，HBsAg在HCC的发生发展中也扮演重要角色。preS2可通过反式激活作用激活肝细胞的癌基因c-myc、c-fos、c-jun等，由preS2与S基因共同编码的MP在其羟基端去掉9个氨基酸残基后，具有反式激活作用[9]。可见X基因的整合和表达是HCC发生的主要因素，其次是P(S)基因片段。本文结果显示，Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期HCC比较，其X、P基因整合率差别均无统计意义。说明病毒整合后导致病情的持续发展，与疾病分期无关，这与有关研究相符[1]。在PBMCs中系统地研究HBV复制与整合的关系及整合在HCC发生中的作用，增加了HCC发生机制的研究方法，又可避免肝脏穿刺活检带来的危险性。

　　[参考文献]

　　[1] CABRERIZO M， BARTOLOMRE J， CARAMELO C， et al.Molecular analysis of hepatitis B virus DNA in serum and pe-ripheral blood mononuclear cells from hepatitis B surface anti-gen-negative cases [J]. Hepatology， 2000，32(1):116.

　　[2] 周 霞秋，廖丹，谢青. 乙型肝炎患者外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒前S/S基因片段的检测[J].中华肝脏病杂志，2000，8:184.

　　[3] 骆 抗先.乙型肝炎基础和临床[M].北京:人民卫生出版社，1997:420.

　　[4] LASKUS T， RADKOWSKI M， WANG L F， et al. Detection and sequence analysis of hepatitis B virus integration in periph-eral blood mononuclear cells[J]. J Virol， 1999，73(2):1235.

　　[5] BLOCK T M， ANAND S， MEHTA A S， et al. Molecular vi-ral oncology of hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene， 2003，22(33):5093.

　　[6] JAYSHREE R S， SRIDHAR H， DEVI G M. Surface， core， and X genes of hepatitis B virus in hepatocellular carcinoma: an in situ hybridization study[J]. Cancer， 2003，99(1):63.

　　[7] MURAKAMI S. Hepatitis B virus X protein: a multifunction-al viral regulator[J]. J Gastroenterol， 2001，36(10):651.

　　[8] MENNE S， TENNANT B C. Unraveling hepatitis B virus in-fection of mice and men (and woodchucks and ducks) [J]. Nat Med， 1999， 5: 1125.

　　[9] TAKADA S. Transactivation function of HBV X protein and tumor suppressor gene p53[J]. Nippon Rinsho， 1995，53:82.