激光荧光检查法在肿瘤定位诊断中的应用

　　作者：刘昊，陈美兰，郭仁舆 作者单位：(西安交通大学医学院：第一附属医院神经外科;第一附属医院激光科;解剖学和组织胚胎学系，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨激光荧光检查法在肿瘤定位诊断中的应用价值。方法 以荧光素钠、光卟啉等作为荧光物质，以氦镉激光、氩Ar+激光和KTP激光作为激发光源，对1400例宫颈病变、56例食道病变、133例胃病变、37例膀胱肿瘤和14例脑肿瘤进行定位诊断，并结合组织形态学方法证实荧光物质在肿瘤组织中的分布特征。结果 激光荧光检查法对上述患者病情均能够明确确诊，对肿瘤的早期定位诊断起到了重要的帮助。结论 激光荧光检查法可作为早期肿瘤的定位诊断方法，值得在临床上广泛使用。

　　【关键词】 激光荧光检查法;肿瘤;诊断

　　Laser photodynamic therapy with hematoporphyrin　derivative in tumor diagnosis

　　Liu Hao, Chen Meilan, Guo Renyu

　　(Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University; Department of Laser Center, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University; Department of Anatomy & Embryology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the efficacy of photodynamic therapy (PDT) for tumor diagnosis. Methods A total of 1400 patients with the cervix of uterus disease, 56 patients with gullet disease, 133 patients with stomach diseases, 37 patients with urinary bladder tumor and 14 patients with brain tumor underwent diagnosis with PDT, combination of Hecd laser, Ar+ laser, and KTP laser. Results All of the patients could be explicitly diagnosed by this method, which indicated that PDT helped greatly in early tumor diagnosis. Conclusion PDT can be an effective diagnostic method for tumors of early stage, and should be widely applied clinically.

　　KEY WORDS: photodynamic therapy; tumor; diagnosis

　　肿瘤组织对含有荧光物质的趋向性吸收比正常组织多而排泄缓慢，在特定光线的照射下肿瘤组织内的荧光物质会被激发出特有荧光。激光荧光检查法是利用肿瘤组织的这一特性来确定肿瘤的位置和范围，为肿瘤、特别是早期肿瘤的定位诊断和治疗提供帮助。自20世纪70年代起始，我院曾用荧光素钠[1]、光卟啉等作为荧光物质，用氦镉激光、氩Ar+激光、KTP激光作为激光光源用于各种肿瘤的定位诊断，并结合组织形态方法，来证实荧光物质在肿瘤组织中的分布特征。现将研究概况简述于下。

　　1 材料与方法

　　1.1 荧光物质 荧光素钠：三苯甲烷衍生物，为生物染料，橙红色粉末，无毒、无味，极易溶于水，在特定波长光的激发下可产生黄绿色荧光，其峰值为522nm。服后半小时血液浓度可达高峰，3-4h后下降，10min后尿内开始排泄，72h排泄完毕。光卟啉：血卟啉的衍生物(hemetopororphyrin derivative, HPD)，其结构与血色素十分相似，为深红色粉末或用其制成的同色水溶液，在吸收360-410nm的波长后可发出630-690nm的红色荧光。进入人体后由肝脏解毒，血液中的半衰期为24h，48-72h正常组织中的光卟啉接近排完。基本无毒，皮肤光毒反应的发生率极低，且极易治疗。

　　1.2 激光 氦镉(HeCd)激光：波长441.6nm，多膜，半外腔，连续输出，功率10-30mW，光学玻璃传导束。该激光用于荧光素钠组。氩(Ar+)激光：波长488-514nm，连续输出，功率0-6W，实用功率200mW，光导纤维传输。KTP激光：是晶体倍频的掺铷钇铝石榴石(NdYAG)激光的简称，波长532nm，功率0-16W，连续脉冲输出，脉冲宽度80-150ns，频率3000-5000pps，光纤传输。Ar+、KTP激光只用于HPD组。各种带有荧光滤光装置的检查镜、内窥镜等辅助检查装置。

　　1.3 给药方法及结果判定标准

　　1.3.1 荧光素钠组 口服：受检查者空腹服用小苏打2g，水200mL(荧光素钠在碱性环境中吸收较好)，10min后服荧光素钠片剂2g，2-8h后进行检查。此给药途径适用于除上消化道部位外的所有病变检查。灌肠：术前排空大便，必要时做清洁灌肠。用2g荧光素钠溶于50mL温水内，保留灌肠4-12h后开始检查。检查：开启激光器，将激光通过内镜传光系统或光导纤维(经活检通道)照向病变组织表面，有黄绿色荧光出现时即为阳性。按其强弱可分为：阳性：呈黄绿色透亮区(黄绿中透白)，有层次感，往往伴有组织外观异常、血管增生等变化;可疑阳性：呈黄绿色荧光区，无立体层次感，无明显组织形态变化或血管异常;阴性：无荧光现象或局部组织异常。

　　1.3.2 光卟啉组 静脉给药：作皮试，阴性者按5mg/kg体重计算给药量，避光静脉快速滴入，于24-48h后开始检查，该法适用于各种部位肿瘤。皮肤贴服法：将HPD注射液不断滴向覆盖与病灶表面的薄棉片上，保持棉片湿润4 h，取掉棉片，仔细清洗病灶表面，经过4-6h，即可开始检查。此法只适用于体表或浅腔洞部位病灶的检查。膀胱灌注法：查前禁水4h，HPD 100mg直接注入排空后的膀胱内。变换体位(保留2-4h内不小便最好)，4-6h后排空膀胱，用膨腔液(硼酸水或生理盐水)冲洗2h后，即可开始检查。只局限于膀胱肿瘤。检查：用药24-48h开始检查，将激光导至病变表面。可在病变处发现有橘红色荧光为阳性，也可呈亮橘红色。血运或含水分较多的肿瘤可呈粉红色或白色透亮感;可疑阳性为散在暗红色区域;阴性，无异常发现，亦无红色点片区。所有检查病例均送活体组织病理检查确定诊断。

　　1.4 组织形态学检查 ①在荧光素钠检查组中取呈阳性结果者胃癌10例、慢性萎缩性胃炎9例、宫颈癌32例、慢性宫颈炎32例，做以下处理并做荧光显微镜观察;另取10例阴性组的慢性宫颈炎标本做同样处理、对照。②取活检组织直接石蜡包埋连续切片，不做任何染色，以荧光显微镜观察荧光的组织分布及其强度。③与前片前后相邻的切片分别染以苏木素伊红及甲绿派诺宁，用一般光学显微镜观察，确定发荧光的组织成分，印证荧光现象与细胞化学所示核酸的关系。④用人的唾液孵育切片，使唾液中的RNA酶消除细胞中的RNA，观察对荧光现象的影响，以判定渗入细胞内的荧光素钠与RNA的关系。

　　2 结果

　　2.1 临床检查结果

　　2.1.1 荧光素钠组 ①宫颈病变：将氦镉激光导向宫颈表面，借助阴道镜辅助观察，共检查宫颈病变1400例，其中宫颈光滑者(阴道镜下也无异常改变)277例，Ⅰ°糜烂287例，Ⅱ°糜烂510例，Ⅲ°病变362例，其他病变12例。其检查结果见表1。

　　表1 激光荧光在阴道的检查结果(略)

　　Table 1 Results of laser fluorescence vaginoscope inspection

　　*Include amoebapalacetrachelitis, granulationtissue, carcinomaofvaginaetal

　　②食道、胃：用氦镉激光作为激光光源，用自制的特殊装置将激光经纤维胃镜的传光束导向病变表面，共检查食道45例、胃107例。其结果为：食道45例，阳性25例，其中鳞癌13例、腺癌1例、重度非典型性增生4例、非典型性增生1例;阴性11例，食道息肉2例、憩室3例、食道炎伴非典型性增生4例、正常2例。胃镜检查107例，其中阳性34例，分别为胃癌24例、萎缩性胃炎+重度非典型性增生7例、胃柿石合并胃溃疡3例;可疑阳性21例，慢性溃疡7例、溃疡+萎缩性胃炎5例、萎缩性胃炎4例、胃柿石伴溃疡2例、胃黏膜脱垂伴胆汁返流伴黏膜糜烂3例。阴性73例中无1例癌症患者，但有萎缩性胃炎+重度非典型性增生9例、胆汁返流性胃炎伴黏膜糜烂5例，余均未发现异常。

　　2.1.2 光卟啉组 由于光卟啉售价昂贵，该组患者均是用于光动力治疗前(直接光动力治疗或手术后癌巢部位的光动力治疗)做定位观察，确定病变位置、手术范围，或第二次治疗前确定上次治疗效果等(该组患者只统计第一次治疗前的检查例数)。由于该组患者均为经病理确诊的病例，因此所有患者均为阳性。其中Ar+检查64例，KTP激光检查24例。其具体为食道11例，鳞癌8例、腺癌3例;胃26例，腺癌24例、溃疡伴重度非典型性增生2例;膀胱37例，乳头状瘤癌变17例、乳头状移行细胞癌14例、膀胱移行细胞癌3例、鳞癌1例、腺癌2例;脑肿瘤14例，胶质瘤9例、恶性脑膜瘤5例。

　　2.2 组织形态学观察

　　2.2.1 荧光素钠组 ①荧光素钠渗入癌细胞的量和癌细胞的活跃程度及血供密切相关。癌细胞密集成较大团块，细胞间无微血管者，胞浆荧光较弱;癌细胞团较小，癌细胞微血管较丰富者，胞浆荧光较强。②癌瘤以及炎症灶中的坏死组织常呈现很强的荧光，可能是被进入组织间隙的荧光素钠污染所致。③浆细胞的荧光较强可能和其中核酸蛋白的含量较多有关，因此在检查中呈假阳性。④上皮组织的基底膜、毛细血管网壁、小动脉内膜、结缔组织纤维，特别是弹性纤维等增生处也可见弱荧光现象。但又比正常组织内的固有荧光强，这可能和炎症使组织增生有关系。

　　2.2.2 光卟啉组 光卟啉的组织显微镜下观察到其主要分布于细胞的胞浆中，胞核分布少，有些细胞胞核内未见有HPD的荧光现象。其癌细胞内的细胞分布规律基本同于荧光素钠，即和癌的结构、血供有很大关系。

　　3 讨论

　　近年来激光荧光定位诊断应用研究逐渐增多。张元芳、吴思恩等[23]用131I同血卟啉衍生物相结合的方法，测定出光卟啉在肿瘤组织中的集中、排除等代谢规律，均证实了其在实验诊断中的作用。

　　激光具有方向性强、亮度高、单色性好、可由光纤传送等特性，因此用激光及激光光源其组织荧光显见度比较好。癌组织中荧光素物质潴留较多，在激光的激发下会呈现出黄白色透亮区，且由于血管壁荧光现象也较强，故常伴有立体感的血管分布，极易将癌与正常组织区分开来。在本研究的宫颈病变普查中，227例宫颈光滑的患者中26例阳性，经活检证实11例为癌，其中宫颈鳞癌II级8例，宫颈鳞状上皮癌3例，对患者的早诊断、早治疗起到决定性作用。但该组检查中有一定的假阳性，约占6.7%，可能是由于炎细胞胞浆丰富，某些炎症(如滴虫感染)常有局部血管的变化等，均可呈现阳性荧光，因此必须注意镜下的形态学变化，协助确诊。食道和胃的检查中，对病变的定位诊断更为准确，其假阳性的出现常和炎症、糜烂等有关，内窥镜下的形态学观察不难区分。组织中的固有荧光也是假阳性出现的原因之一[4]，因此在组织形态学的观察中也应特别注意。但该荧光一般较弱，和使用光敏剂后产生的荧光强度无法比拟。

　　激光荧光定位下的手术治疗报道，最早见于1948年。我院起始于1982年，最早用Ar+激光+NdYAG激光激发HPD用作胃、食道及膀胱肿瘤的定位诊断及肿瘤激光切除，并后续用Ar+泵浦罗丹明激光做光动力治疗，于2005年开始用KTP激光激发HPD做定位诊断，继之用KTP激光对肿瘤行手术切除及热疗，使肿瘤的雕刻式彻底清除成为可能。国内近年来有关应用HPD做光动力学治疗的报道很多[5]，但多用630nm的红色激光，组织和周边均呈红色无明显荧光反差;而KTP为绿色激光，辐照下肿瘤组织因富含HPD呈红色，周边仍呈绿色，反差明显，且KTP激光同时具有切割、热疗和光敏化的作用，因此KTP激光应作为HPD定位诊断中的首选激光。

　　荧光素钠在肿瘤组织及正常组织中的分布存在明显差异性的报道很多，对在肿瘤细胞内的存在也都达到共识[6]，但荧光素钠是怎样进入肿瘤细胞的，和肿瘤细胞的哪种物质相结合，目前还不清楚。荧光素钠因无毒而临床应用比较安全。本研究病例中患者使用后未观察到皮肤的光敏反应，但有5例患者因皮肤、巩膜的黄染而引起恐慌，未作任何治疗而逐渐消退，因此要注意事前向患者说明。HPD使用过程中应避免阳光直射，最好处于避光状态。本研究病例中曾有7人因晒日光而引起皮肤的光敏反应，经抗过敏治疗后很快治愈。因HPD为血液生化制品，价格昂贵(是荧光素钠售价的千倍以上)，因此不宜用作普查，但作为手术和光动力治疗的定位诊断则有其独特作用。

　　总之，激光荧光检查法在肿瘤的定位诊断中的地位和价值逐步得到大家的认可，值得临床广泛推广。

　　【参考文献】

　　[1]李维清，陈美兰. 激光荧光阴道镜联合检查法对宫颈癌早期诊断的研究 [J]. 陕西新医药, 1982, 11(7):2527.

　　[2]张元芳，张道新，程绍亮，等. 131 I 标记血卟啉衍生物及其在膀胱癌放射显像中的应用 [J]. 中国激光医学杂志, 1996, 5(1):2023.

　　[3]吴思恩，王勉镜，方庆荣 ，等. 131 I标记血卟啉衍生物诊断恶性肿瘤的实验动物观察 [J]. 中国激光医学杂志, 1996, 5(1):2426.

　　[4]殷光中，谭纪伏，于常青，等. 胃癌荧光光谱特性初步研究 [J]. 中国激光医学杂志, 2004, 13(4):232235.

　　[5]徐国祥. 激光医学 [M]. 北京：人民卫生出版社， 1998:165172; 286299.

　　[6]赵世光，滕雷，赵洪波，等. 荧光引导鼠脑胶质瘤切除的实验研究 [J]. 中华神经外科杂志, 2006, 22(2):120122.