乳腺癌组织中Ezrin和CD44v6的表达及其意义

　　作者：马小斌，王西京，刘小旭，康华峰，代志军，薛锋杰，薛兴欢 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院肿瘤外科，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 探讨Ezrin及CD44v6与乳腺癌发生发展及浸润转移的关系，研究其在乳腺癌中表达的意义及二者的相关性。方法 应用免疫组化SP法测定Ezrin及CD44v6的表达。结果 ①Ezrin及CD44v6在浸润性导管癌组表达(70.3%和82.8%)均高于导管内癌组(44.4%和50.0%)，乳腺癌组表达(64.4%和75.6%)均高乳腺增生组(23.1%和26.9%)，差异有统计学意义(P<0.05)，而普通导管增生组与不典型增生组比较表达差异无统计学意义(P>0.05);②在浸润性导管癌中，Ezrin及CD44v6表达均与患者年龄无关，与原发肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，但Ezrin表达与淋巴结转移数目有关(0.010.05);③在浸润性导管癌及在腋淋巴结转移阳性组，二者表达呈显著正相关，在导管内癌及腋淋巴结转移阴性组无相关性。结论 Ezrin与CD44v6高表达均与乳腺癌发生发展有关，与乳腺癌浸润及腋淋巴结转移关系密切，二者表达呈正相关，联合检测Ezrin与CD44v6有助于综合判断乳腺癌的恶性程度和浸润转移潜能。

　　【关键词】 乳腺肿瘤;Ezrin;CD44v6;免疫组织化学

　　The expression of Ezrin and CD44v6 in human breastcancer tissue and its significance

　　Ma Xiaobin, Wang Xijing, Liu Xiaoxu, Kang Huafeng,Dai Zhijun, Xue Fengjie, Xue Xinghuan

　　Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the expression of Ezrin and CD44v6 in human breast cancer tissue, study their relationship with the genesis, development, infiltration and metastasis of breast cancer, and analyze their expression significance and their correlation with each other. Methods The expression of Ezrin and CD44v6 in all specimens was detected by SP immunohistochemistry. Results ① The expression of Ezrin and CD44v6 in infiltrating ductal carcinoma (70.3% and 82.8%) was higher than that in intraductal carcinoma (44.4% and 50.0%), with significant difference (P<0.05). Comparing groups of breast hyperplasia (23.1% and 26.9%) with breast cancer (64.4% and 75.6%), the difference was also significant (P<0.05). There was no statistical significance between the groups of usual ductal hyperplasia and atypical ductal hyperplasia (P>0.05); ② The overexpression of Ezrin and CD44v6 in breast infiltrating ductal carcinoma had no relationship with age, but had some relationship with the size of primary tumor, histological classification, clinical TNM staging, and lymph node metastasis (P<0.05), but the expression of Ezrin had relationship with the number of metastatic lymph node (0.010.05); ③ In the group of breast infiltrating ductal carcinoma, they showed significant direct correlation with each other, so did in the lymph node positive group. Conclusion The overexpression of Ezrin and CD44v6 had relationship with the genesis and development of breast cancer, also with infiltration and axillary lymph node metastasis. They showed significant direct correlation with each other, detecting Ezrin and CD44v6 in combination was helpful to synthetically judge the malignance of breast cancer and its potentiality of infiltration and metastasis.

　　KEY WORDS: breast tumor; Ezrin; CD44v6; immunohistochemistry

　　Ezrin为膜细胞骨架连接蛋白(membrance cytoskeleton cross linker protein)，是定位于人染色体6q25.2-q26 Vil2基因表达的产物[1]。体内外研究显示，在多种恶性肿瘤中Ezrin的表达与肿瘤浸润转移有关[2]。分化抗原(cluster of differentiation, CD)CD44家族是单链细胞表面I类跨膜糖蛋白，属于黏附分子。根据基因表达模式分为标准型CD44(CD44s)和变异型CD44(CD44v)，CD44v6作为CD44v主要成员之一，在多种人体恶性肿瘤的发生和浸润转移过程中发挥重要作用[3]。研究表明Ezrin与CD44能形成复合体影响恶性肿瘤浸润转移[4]，而CD44v6为CD44主要变异体之一。本研究应用免疫组化SP法测定二者的表达，探讨Ezrin和CD44v6与乳腺癌发生发展及浸润转移中的关系，研究其在乳腺癌中表达的意义及二者的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　收集我院2003年至2006年乳腺组织存档蜡块134例，其中乳腺普通导管增生28例、乳腺不典型导管增生24例、乳腺导管内癌18例及乳腺浸润性导管癌64例，全部病例均经手术和病理证实。64例乳腺浸润性导管癌患者年龄34-65岁，平均47.24岁。按Scarff-Bloom-Richardson(SBR)分级标准进行组织学分级：Ⅰ级24例，Ⅱ级19例，Ⅲ级21例。按(AJCC)TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期24例，Ⅲ+Ⅳ期27例。标本均已用10%(体积分数)甲醛溶液固定，常规石蜡包埋处理，组织切片厚度5 μm。

　　1.2 试剂与方法

　　小鼠抗人Ezrin单克隆抗体，工作液浓度1∶50，购自Labvision公司;兔抗人CD44v6单克隆抗体，工作液浓度1∶100，购自武汉博士德生物工程公司;SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片经脱蜡、梯度水化后，置10 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，热平台修复抗原3 min，凉至室温。3%(体积分数)过氧化氢室温孵育20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。正常兔血清封闭非特异性抗原15 min，倾去多余血清，滴加小鼠抗人Ezrin单克隆抗体，4 ℃放置过夜。PBS洗3 min×3 min后，滴加生物素化二抗，37 ℃放置30 min;PBS洗3 min×3 min后，滴加SP，37 ℃放置30 min。DAB显色;苏木精复染;中性树脂封片。以肺组织阳性切片作为Ezrin阳性对照，胃癌组织阳性切片作为CD44v6阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。

　　1.3 评定标准

　　Ezrin阳性表达在细胞膜和胞浆内呈棕黄色颗粒。用双盲法，按染色强度和阳性表达细胞数比例，参考Li等[5]的分级标准，-：无表达;+：<50%细胞阳性表达或染色较浅;：≥50%阳性表达且深染。为异常阳性表达。

　　CD44v6分布于细胞膜和细胞浆的棕黄色颗粒，用双盲法，免疫组化法评分和结果判定参照Fromowitz方法[6]，染色强度计分：无着色为阴性，计0分;浅黄色为弱阳性，计1分;棕黄色为阳性，计2分;棕褐色为强阳性，计3分。阳性范围：<5%为0，5%-25%为1，26%-50%为2，51%-75%为3，>75%为4，两者相加<2为(-)，2-3为(+)，4-5()，6-7()。

　　1.4 统计学分析

　　运用SPSS 13.0对实验数据进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法，等级资料的相关性采用Spearman等级相关分析，计算相关系数(R)进行相关性分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Ezrin在不同乳腺病理类型中表达的结果

　　在乳腺普通导管增生、不典型导管增生、导管内癌、浸润性导管癌组Ezrin异常阳性表达率分别为21.4%、25.0%、44.4%、70.3%(图1)，异常阳性率逐渐升高，差异有统计学意义(χ2=25.81, P<0.01)。乳腺普通导管增生组(21.4%)与不典型导管增生组(25.0%)相近，差异无统计学意义(χ2=0.09, P>0.05)。乳腺导管内癌(44.4%)与浸润性导管癌(70.3%)比较，差异具有统计学意义(χ2=4.11, 0.01

　　2.2 CD44v6在不同乳腺病理类型中表达的结果

　　在乳腺普通导管增生、不典型导管增生、导管内癌及浸润性导管癌组CD44v6阳性率分别为25%、29.1%、50%、82.8%(图2)，阳性率随病理类型进展而升高，差异有显著统计学意义(χ2=36.98, P<0.01)。在乳腺普通导管增生组(25.0%)与不典型导管增生(29.1%)之间相近，差异无统计学意义(χ2=0.11, P>0.05)。而在乳腺导管内癌与浸润性导管癌中阳性率分别为50.0%、82.8%，差异有显著统计学意义(χ2=6.52, P<0.01)。乳腺增生组，CD44v6阳性表达率为26.9%，乳腺癌组CD44v6阳性表达率为75.6%，差异有统计学意义(χ2=30.73, P<0.01，表1)。表1 Ezrin与CD44v6在不同乳腺病理类型中的表达(略)

　　2.3 Ezrin表达与乳腺浸润性导管癌临床病理参数的关系

　　在浸润性导管癌中，Ezrin在不同年龄组异常阳性表达率差异无统计学意义(χ2=2.20, P>0.05)，在不同原发肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期及腋淋巴结转移组中异常阳性表达率不同，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且Ezrin表达与腋淋巴结转移数目有关(χ2=4.17, P<0.05)，腋淋巴结转移越多，其表达越高(表2)。

　　2.4 CD44v6表达与乳腺浸润性导管癌临床病理参数的关系

　　在浸润性导管癌中，在不同年龄组CD44v6阳性率虽然不同，但差异无统计学意义(χ2=0.00, P>0.05)。在不同原发肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期及腋淋巴结转移分组阳性表达率间差异均有统计学意义(P<0.05)，但CD44v6表达与腋淋巴结转移数目无关(P<0.05，表2)。表2 Ezrin与CD44v6表达与乳腺浸润性导管癌临床病理参数的关系(略)

　　2.5 Ezrin与CD44v6表达的相关性

　　在浸润性导管癌中，Ezrin阳性表达组CD44v6阳性占91.1%，阴性表达组占63.2%，差异有统计学意义(P<0.05)，Spearman等级相关分析结果表明二者表达呈显著正相关(R=0.339, P<0.01)。在40例腋淋巴结转移阳性的浸润性导管癌中，Ezrin阴性表达组中CD44v6阳性率(62.5%)明显低于其在Ezrin阳性表达组(100%)，差异有统计学意义(P<0.01)，二者表达呈显著正相关(R=0.569, P<0.01)。在导管内癌及腋淋巴结转移阴性组均无相关性(P>0.05，表3、4)。表3 Ezrin与CD44v6在浸润性导管癌中表达的相关性(略)表4 Ezrin与CD44v6在淋巴结转移阳性浸润性癌组织中表达的相关性(略)

　　3 讨 论

　　Ezrin为膜细胞骨架连接蛋白，1983年由Bretscher在鸡的小肠上皮刷状缘纯化，1989年Gould等克隆得到人Ezrin cDNA并将其测序。生理状态下，Ezrin能维持细胞极性、参与细胞运动、细胞间及细胞与ECM黏附，调节免疫细胞功能，并与细胞衰老凋亡有关[7-9]。在多种恶性肿瘤中，Ezrin高表达与肿瘤浸润转移有关，其通过改变肿瘤细胞极性及细胞运动、调节肿瘤细胞间黏附及细胞与细胞外基质黏附、参与肿瘤细胞内信号转导而影响恶性肿瘤浸润转移[1]。但是，Ezrin与恶性肿瘤的发生关系研究较少。最近研究发现，Ezrin与细胞凋亡有密切关系[9]，Ezrin通过连接FAS与肌动蛋白细胞骨架，从而促发FAS通路引起细胞凋亡。肿瘤细胞都存在抗FAS诱导凋亡的现象，FAS-Ezrin连接、FAS-actin连接和FAS调节的细胞极化都会影响细胞对FAS诱导凋亡的反应性。一旦FAS-Ezrin连接异常就会诱发细胞的抗凋亡现象。由此推测，Ezrin可能通过此途径影响恶性肿瘤的发生。本研究结果显示Ezrin在乳腺癌组表达(64.4%)显著高于乳腺增生组，提示Ezrin可能参与了乳腺组织由增生到癌的发生发展过程。比较导管内癌组(44.4%)与浸润性导管癌组(70.3%)，Ezrin表达差异有统计学意义，在腋淋巴结转移阳性组表达显著高于阴性组，并且转移数目越多其表达越高。提示其高表达在乳腺癌浸润及淋巴结转移过程中发挥重要作用。另外，数据显示Ezrin高表达与原发肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期等预后指标有关。提示Ezrin与乳腺癌预后有一定关系。

　　CD44v6作为CD44v主要成员之一，是单链细胞表面I类跨膜糖蛋白，属于黏附分子，1991年Gunthert等[10]首次发现CD44v6，同时观察到其与恶性肿瘤发生发展及浸润转移关系密切。近年来国内外对其研究甚多，研究显示其与多种恶性肿瘤浸润转移有关[11]。CD44v6与乳腺癌发生发展及预后的关系尚未能完全定论，需进一步的探索。但是，CD44v6高表达与乳腺癌浸润转移呈正相关的观点基本一致[12-13]。本研究显示CD44v6参与乳腺癌发生发展、浸润及淋巴结转移，但与淋巴结转移的数目无关(P>0.05)。这可能由于CD44v6影响恶性肿瘤淋巴结转移多少尚受其他因素的制约。另外，数据显示CD44v6高表达与原发肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期等预后指标有关，与Ma等[13]研究基本一致。

　　Ezrin能与CD44形成复合体而发挥作用，CD44v6作为CD44主要变异体，其胞浆区能与Ezrin形成复合体[14]。Ezrin在细胞内作为CD44v6的锚定分子，使CD44v6与细胞骨架连接起来，进而改变肿瘤细胞的运动能力，介导肿瘤细胞转移，同时与细胞外基质中配体结合，导致肿瘤细胞形态、游走性的改变，为肿瘤细胞的迁移奠定基础。另外，肝细胞生长因子(HGF)结合Met后，Met的磷酸化需要其共受体CD44v6在胞浆区募集Ezrin，于是，HGF、Met、CD44v6及Ezrin形成复合物，激活下游信号分子。而Met已被证实与多种恶性肿瘤的进展有关[15]。本研究数据显示，在浸润性导管癌及腋淋巴结转移阳性组二者表达呈正相关，而在导管内癌及腋淋巴结转移阴性组间无相关性。这提示Ezrin与CD44v6能相互作用影响乳腺癌的浸润转移，并通过CD44v6发挥作用。

　　总之，Ezrin与CD44v6高表达均匀乳腺癌发生发展及浸润淋巴结转移有关，与原发肿瘤大小、组织学分级及cTNM分期等预后指标关系密切，并且二者表达呈正相关。联合检测Ezrin与CD44v6有助于综合判断乳腺癌的恶性程度和浸润转移潜能。

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