T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1表达水平在胃癌淋巴结转移中的意义

　　作者：续薇，单洪丽，刘力华，张恩颖，关宝杰，王冠军 作者单位：吉林大学第一医院检验科，吉林长春 130021

　　【摘要】 目的 定量检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)在胃癌组织中的表达水平，探讨并评价其在胃癌淋巴结转移中的作用。方法 采用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，定量检测66例胃癌患者癌组织、癌旁组织及11例胃良性病变组织中的Tiam1 mRNA拷贝数，同时将CK18作为淋巴结微转移的标志基因，定量检测24例病理诊断无淋巴结转移的胃癌患者199枚淋巴结的CK18mRNA拷贝数。结果 66例胃癌患者的癌组织92.42%(61/66)Tiam1 mRNA表达阳性，而癌旁为19.70%，胃良性病变组织11例只检测到1例Tiam1 mRNA表达，胃癌组织Tiam1 mRNA阳性率高于癌旁组织(χ2=70.86)和良性病变组织(χ2=41.74)(均P<0.01)，差异有统计学意义(χ2=78.96，P<0.01)。胃癌组织中Tiam1 mRNA表达量明显高于癌旁和良性病变组织(4.92×105 vs. 0)。66例患者根据淋巴结转移分为3组;24例病理无淋巴结转移的胃癌患者通过淋巴结CK18mRNA的定量检测， 15例存在微转移。微转移组(9.51×104)及病理转移组(2.99×106)Tiam1 mRNA表达量明显高于未转移组(4.54×102，P<0.01)。结论 Tiam1与胃癌淋巴结转移密切相关。胃癌组织Tiam1表达水平可能决定癌细胞淋巴转移的倾向，可以成为术前评估转移的实验诊断参考指标。

　　【关键词】 Tiam1;CK18;胃癌;转移;微转移

　　inducing factor 1 in lymph node metastasis of gastric carcinomasXU Wei, SHAN Hongli, LIU Lihua, ZHANG Enying, GUAN Baojie, WANG Guanjun

　　(Department of Clinical Laboratory, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)ABSTRACT: Objective To detect quantitatively the expression level of T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1 (Tiam1) in gastric carcinoma tissues, and evaluate the role of Tiam1 in lymph node metastasis of gastric carcinomas. Methods Realtime fluorescence quantitive RTPCR (RTFQPCR) was used to detect the expression level of Tiam1 mRNA in gastric cancer tissues of 66 cases, paracancerous tissues (over 3cm) of 66 cases and gastric benign lesion tissues of 11 cases. Meanwhile, CK18 was selected as the hallmarker for lymph node micrometastasis to detect the level of CK18 mRNA expression in 199 lymph nodes from 24 cases of gastric carcinomas diagnosed negative by pathologic examinations. Results The positive rate of Tiam1 mRNA expression in gastric cancer tissues and paracancerous tissues was 92.42%(61/66) and 19.70%(13/66), respectively, and only one case in 11 gastric benign lesion tissues expressed Tiam1 mRNA. There were significant differences (P<0.01) among the three groups of patients. The positive expression rate of Tiam1 mRNA in gastric cancer tissues was much higher than that in the paracancerous tissues (χ2=70.86) and gastric benign lesion tissues (χ2=41.74) (P<0.01). The expression level of Tiam1 mRNA in gastric cancer tissues was much higher than that in the paracancerous tissues and gastric benign lesion tissues (4.92×105 vs. 0). The 66 cases were divided into three groups according to the degree of lymph node metastasis. 15 cases had micrometastasis, 24 cases of gastric carcinomas were diagnosed negative by pathologic examinations. The level of Tiam1 expression in micrometastasis group (9.51×104) and metastasis pathologically group (2.99×106) was much higher than that in nonmetastasis group (4.54×102, P<0.01). Conclusion There is a close correlation between Tiam1 and lymph node metastasis of gastric carcinomas. The expression level of Tiam1 in gastric carcinomas probably determines the metastasis tendency of cancerous cells, and can serve as a reference index of laboratory diagnosis in evaluating metastasis preoperatively.

　　KEY WORDS: Tiam1; CK18; gastric carcinoma; metastasis; micrometastasis

　　近年来，大量研究已经证明T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1, Tiam 1)与多种肿瘤侵润转移密切相关[13]。采用TaqMan探针实时荧光定量RTPCR(realtime fluorescence quantitive RTPCR，RTFQPCR)方法，以细胞角蛋白CK18作为淋巴结微转移的标志基因，定量检测了胃癌无转移组、胃癌病理转移组、胃癌微转移组和胃良性病变组中Tiam1 mRNA水平，表明Tiam 1与胃癌淋巴结转移密切相关。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象和材料 吉林大学第一医院和第二医院外科2005年1月至2006年10月确诊为胃癌的手术患者66例，其中男49例，女17例，年龄42～81岁，平均年龄63岁。同期门诊内镜科及普外科收治良性病变的患者11例，其中男6例，女5例，年龄34～79岁，平均年龄56岁。标本来源为胃癌患者术中切除的癌组织，胃良性病变组织(溃疡、息肉、炎症)经胃镜或病理留取，同时留取胃癌哨兵淋巴结199枚，除了送检病理者外，所有标本立即储于液氮罐，提取总RNA。

　　1.2 RNA的提取 取100mg冷冻组织，按Trizol操作说明提取总RNA。18g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定质量。紫外分光光度计(Beckman公司，DU640)测A 260值计算总RNA浓度，A 260/A280值在1.98～2.0之间。

　　1.3 引物和探针 参照GenBank中人Tiam1 mRNA和CK18 mRNA序列，由上海生工公司设计合成引物各1对和各自的TaqMan荧光探针：Tiam1引物：上游5′GCGCATTCTCACAGACTTAGAA3′，下游5′TGGAAATGATGTCCGGATGA3′。Tiam1荧光探针：5′FAMACTGTGATGGCCACCGCAGGGTAMRA3′，扩增产物102bp。CK18引物为：上游：5′GGCATCCAGAACGAGAAGGA3′，下游：5′AGTGCTCCCGGATTTTGCT3′。CK18荧光探针：5′FAMATGCAAAGCCTGAACGACCGCCTAMRA3，扩增产物121bp。

　　1.4 标准曲线的建立 Tiam1[4]和CK18标准曲线建立方法相同，均采用TA克隆构建重组质粒。重组质粒的鉴定包括限制性酶切、PCR和序列分析(Takara Co.)。实验前标准品10倍系列稀释，109～100。定量RTPCR。仪器测定Ct值，绘制标准曲线。

　　1.5 Tiam1和CK18定量RTPCR 取5μg总RNA，50μL体系定量逆转录，反应产物置-20℃贮存备用。PCR扩增采用ABI 7000 PCR系统，上、下游引物各1μL，探针1μL，ExTaq 0.5μL。按如下条件行实时荧光定量PCR：95℃预变性5min，95℃ 45s，60℃ 1min，72℃ 45s，共40个循环。

　　1.6 统计学处理 所有实验数据应用SAS统计软件分析。阳性率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率法;不同分组之间Tiam1量值水平比较采用KruskalWallis 秩和检验，P<α/n-1，α=0.05，有统计学意义，可以避免Ⅰ类错误。Tiam1与CK18相关性分析采用Spearman等级相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 胃癌组织、癌旁组织及胃良性病变组织中Tiam1 mRNA表达阳性率及量值水平 胃癌组织Tiam1表达阳性率为92.42%，癌旁组织为19.70%，而11例良性病变组织只有1例Tiam1表达。癌组织Tiam1表达阳性率高于癌旁(χ2=70.86)和良性病变组织(χ2=41.74，均P<0.01，图1)。

　　61例癌组织Tiam1阳性表达的中位数(Md)为7.38×105，癌旁组织13例Tiam1阳性，表达的中位数为2.78×104，低于癌组织。11例良性病变胃组织中只有1例检测到Tiam1表达，拷贝数为3.71×104(图2)。

　　2.2 Tiam1表达水平与胃癌转移的关系 根据是否存在淋巴结转移，及以CK18作为微转移标志对患者分组，分为无转移组(Negative)、微转移组(MM)、转移组(N1～3，UICC 1997)。在各分组中Tiam1表达水平以Log(中位数)表示，如图3所示：无转移组为2.54、微转移组为4.98、N1组为6.56、N2组为5.87、N3组为7.34。无转移组Tiam1表达水平低于微转移组和转移组，统计学差异显著(χ2kw=17.885，P=0.0001)。

　　2.3 Tiam1表达水平与胃癌微转移的关系 在24例病理无转移的患者中，15例患者的44枚淋巴结CK18表达阳性，占22.1%(24/199)。15例微转移病例中，最大值1.08×108，最小值为2.57×102。无转移组患者，我们以癌组织Tiam1表达拷贝数的对数对淋巴结CK18 mRNA拷贝数的对数作图，其中1例CK18>106，而Tiam1为0的患者没有包括在内(图4)。图4显示两者之间存在良好的线性相关性：相关系数r=0.827，绝大多数测量数据位于95%可信区间内或其附近。

　　2.4 Tiam1表达水平对胃癌淋巴结转移和微转移的评估 根据是否存在淋巴结转移对患者分组，分为无转移组(Negative)、微转移组(MM)、转移组(N1～3)。其中Negative组中9例Tiam1表达水平均<4.0×104，而以1.0×104作为转移的标准，Negative组中有2例高于这个标准，其中1例为低分化癌。微转移组15例患者2例小于1.0×104，其他13例全部高于4.0×104。转移组中，34例(81.00%)高于4.0×104。而大于1.0×104共37例(88.10%)(表1)。表1 Tiam1表达水平对胃癌淋巴结转移和微转移的评估

　　3 讨 论

　　3.1 Tiam1高表达是胃癌在分子水平的重要特征 近年来，采用血清学方法或RTPCR对T/B细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌和胰腺癌等40多个人和啮齿类原发性肿瘤细胞系的检测发现：Tiam 1在所有的肿瘤细胞中都表达，且基于相对定量其表达水平依肿瘤细胞侵袭转移能力的增强而升高[56]。国内李新元等[7]还发现, Tiam 1在人胃癌、食管癌、甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胆囊癌、子宫内膜癌、膀胱移行细胞癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达，特别在低分化的和伴有局部浸润或远处转移的腺癌、鳞癌组织中呈强阳性表达，上述研究均为相对半定量的结果。

　　本研究采用TaqMan水解探针的RTFQPCR对胃癌组织Tiam1 mRNA进行定量检测，结果显示：胃癌组织的Tiam1表达阳性率显著高于癌旁组织及良性病变组织，差异有明显的统计学意义。这提示Tiam1的表达与胃癌有关，这与其他作者的研究结果一致[78]。

　　11例良性胃病变组织中10例未检测到Tiam1mRNA，1例胃良性溃疡患者Tiam1 mRNA表达量为3.71×104拷贝，大于癌旁组织的表达中位数(Md=2.78×104)。该阳性个体是否具有恶性转化的趋势或遗传背景，还有必要进行跟踪观察。

　　Tiam1表达的定量分析表明：Tiam1表达阳性个体癌旁组织的中位数明显低于癌组织。而且对患者按照个体水平配对，胃癌组织Tiam1拷贝数大多数超过癌旁组织的100倍。只有3例例外，它们的Tiam1拷贝数是癌旁组织的5～20倍。由此说明，存在与胃癌相关的Tiam1异常超表达。

　　3.2 胃癌组织Tiam1表达与转移、微转移的关系 微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，直径达到1～2mm，同时伴随基质反应和新生血管形成的转移病灶[9]。近年来，国内外学者已经形成共识，CK家族的淋巴结表达可以作为有无微转移的判断标志。MASUDA T[10]和KHAIR[11]已经发表了相关的综述。因此，本研究采用TaqMan探针实时荧光定量RTPCR方法，以淋巴结CK18的表达作为鉴定微转移的标志，定量分析24例病理诊断无淋巴结转移的胃癌患者的199枚淋巴结。结果显示：15例患者(62.50%)的44枚淋巴CK18阳性表达(22.11%)，较文献报道[12]的RTPCR方法检测到的阳性率(17.1%)提高5%。15例中有2例Tiam1的拷贝数低于104，另外13例Tiam1表达水平均在104以上。更为重要的是：结果显示胃癌组织Tiam1拷贝数与淋巴结的CK18拷贝数之间存在正相关。这说明胃癌组织Tiam1定量检测可以评估是否存在淋巴结微转移。

　　在42例胃癌病理转移患者中，只有1例Tiam1表达阴性，80%以上的病例Tiam1超过1.0×104。这说明Tiam1表达水平同样适于评价胃癌的病理转移。

　　3.3 Tiam1表达水平对胃癌淋巴结转移的评估 通过胃镜留取胃组织通常可以收获足可以作PCR检测的标本，这为术前评价转移提供了可能性。因此，通过实时定量检测Tiam1表达的绝对值是否有可能判断胃癌的生物学行为，特别是转移的发生，这也是本研究设计的初衷之一。我们的实验发现Tiam1表达水平与胃癌的转移与微转移都有一定的关联：没有转移的患者很难检测到Tiam1表达，而微转移和转移患者Tiam1的表达，若以超过1×104界线值，敏感性分别为86.67%和88.10%，特异性均为90.91%;若以>4×104界线值，敏感性分别为86.67%和81.00%，特异性均为100%。因此，我们认为胃癌组织Tiam1拷贝数>4.0×104可以作为反映淋巴结转移的医学决定水平，并将有可能成为术前评估转移的实验诊断参考指标。

　　综上所述，Tiam1存在与胃癌相关的超表达，应用RTFQPCR方法在通过胃镜留取胃组织进行Tiam1定量检测，通过其表达水平初步评估胃癌患者的转移情况，进而决定手术方式。因此，对胃癌患者的临床治疗具有重要的指导意义。

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