晚期胃癌病人血清XRCC1基因多态性与奥沙利铂化疗效果的相关性

　　作者：姜健，梁军，李青芳，宋珊爱，孙莹莹 姜健(1984),女, 硕士。 作者单位：(青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003) 山东省自然科学基金资助项目(Y2008C126)

　　【摘要】 目的 探讨XRCC1 Arg399Gln(G→A)基因多态性与晚期胃癌对以奥沙利铂为主的化疗敏感性的关系。方法 晚期胃癌病人94例(Ⅲ期34例，Ⅳ期60例),应用以奥沙利铂为主的方案化疗，对60例Ⅳ期病人化疗2～3个周期后进行临床疗效评价，全部病人统计至疾病进展时间(TTP)。应用TaqManMGB探针等位基因分型技术进行基因分型。结果 54.26%病人基因型为G/G，8.50%为A/A，37.24%为G/A。Ⅳ期60例病人化疗后临床获益率(CR+PR+SD)为70%,G/G、G/A+A/A在化疗敏感组(CR+PR+SD)与不敏感组(PD)中的分布差异有显著性(χ2=6.747,P<0.05;OR=4.680，95%CI=1.397～15.682,P=0.009)。94例病人中位TTP为9.0 个月，G/G基因型为10.5个月，G/A+A/A基因型为7.0个月，两者比较差异有显著性(χ2=7.113,P<0.01)。结论XRCC1 Arg399Gln基因多态性可能与晚期胃癌病人对奥沙利铂化疗的敏感性及生存时间相关。

　　【关键词】 胃肿瘤;基因;多态性,限制性片段长度;奥沙利铂;药物疗法;X线修复交叉互补基因1

　　GENETIC POLYMORPHISM OF XRCC1 CORRELATED WITH THE OXALIPLATIN CHEMOTHERAPY FOR PATIENTS WITH ADVANCED GASTRIC CANCER

　　JIANG JIAN, LIANG JUN, LI QINGFANG, et al

　　(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To study the correlation between genetic polymorphisms of XRCC1 Arg399Gln (G→A) and response to oxaliplatinbased chemotherapy in patients with advanced gastric cancer (AGC). Methods Ninetyfour patients with AGC (34 with stage Ⅲ, and 60 with stage Ⅳ) were treated with oxaliplatinbased chemotherapy. Clinical efficiency in 60 patients with stage Ⅳ was assessed after 2-3 cycles of therapy, all the patients were followed until time to progress (TTP). XRCC1 genotypes were detected by TaqManMGB probe methods. Results 54.26% were G/G genotype, 8.50% were A/A genotype, and 37.24%were G/A genotype. The clinical benefit rate (CR+PR+SD) was 70%. Patients with G/G genotype showed distinct preponderance compared to those with G/A+A/A, between response group (CR+PR+SD) and nonresponse group (SD) (χ2=6.747,P<0.05;OR=4.680,95% CI=1.397-15.682,P=0.009).The median TTP of all patients was 9 months; G/G genotype was 10.5 months; G/A and A/A was 7.0 months. The significant differences between them were noticed (χ2=7.113,P<0.01).Conclusion The XRCC1 Arg399Gln genetic polymorphisms may be associated with the clinical response to oxaliplatinbased chemotherapy and survival time in patients with advanced gastric cancer.

　　[KEY WORDS] stomach neoplasms; gene; Polymorphism, restriction fragment length; oxaliplatin; drug therapy; Xray repair cross complementing 1

　　奥沙利铂是第三代铂类抗肿瘤药，为细胞周期非特异性药物,该药以DNA为作用靶点，铂原子与DNA链形成交联，从而阻断其复制和转录。奥沙利铂与氟尿嘧啶临床抗癌有协同作用，以两者为基础的化疗方案是目前晚期胃癌治疗的常用方案之一。X线修复交叉互补基因1 (XRCC1) 是参与碱基切除修复(BER)且与铂类药物抵抗有关的重要因子，该基因第10号外显子上第399位密码子的单核苷酸多态性(SNP)导致氨基酸的替代变化(精氨酸→谷氨酰胺),从而可以改变DNA损伤修复能力,影响个体对铂类药物的敏感性。多项研究结果显示,XRCC1 Arg399Gln多态性与铂类药物对肺癌[12]、结肠癌[3]等肿瘤细胞的疗效有关。但目前关于XRCC1基因多态性与胃癌化疗疗效的关系研究很少。本研究以接受铂类化疗的中国人种胃癌病人为研究对象,检测XRCC1基因第399位密码子多态性,探讨XRCC1基因多态性与化疗敏感性及预后的关系。现将结果报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　2007年7月—2009年4月，收集我科治疗的晚期胃癌病人94例(Ⅲ期34例，Ⅳ期60例)，均经病理学确诊，其中男60例，女34例;年龄32～77岁，中位年龄55岁。所有病人ECOG评分≤2，预计生存期>3个月。Ⅳ期病人有经CT、MRI等扫描可测量的实体病灶。所有病人无重要器官功能严重受损，血常规、肝肾功能在正常范围内，心电图正常。所有研究对象均知情并签署知情同意书。

　　1.2 化疗方法

　　40例应用改良FOLFOX4方案、54例应用Xelox方案化疗。改良FOLFOX4方案：奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)130 mg/m2，静滴2 h，第1天;亚叶酸钙(江苏恒瑞医药股份有限公司)130 mg/m2，静滴2 h，第1～5天;氟尿嘧啶(南京金耀氨基酸有限公司)300 mg/m2，静滴4 h, 第1～5天;每3周重复。Xelox方案：奥沙利铂130 mg/m2，静滴2 h，第1天;卡培他滨(Xeloda，HaffmannLa Roche Inc)1 000 mg/m2口服，每天2次,第1～14天，每3周重复。

　　1.3 疗效评定

　　对Ⅳ期病人化疗2～3个周期后，采用2000年RECIST统一标准进行疗效评价。①完全缓解(CR)：所有目标病灶消失;②部分缓解(PR)：基线病灶最大径之和至少减少30%，至少维持4周;③稳定(SD)：基线病灶最大径之和有减少但未达PR或有增加但未达进展(PD); ④PD：基线病灶最大径之和至少增加20%或出现新病灶。将达到CR、PR或SD病人归为化疗敏感组，PD为化疗不敏感组。观察病人2周期临床获益率(CR+PR+SD)及至疾病进展时间(TTP)。所有病人随访至2009年7月1日，中位随访时间为13.2个月(3～24个月)。

　　1.4 TaqMan等位基因分型

　　每位病人化疗前均留取EDTANa抗凝外周血2 mL备用。应用血液基因组DNA快速抽提纯化试剂盒 (北京百泰克生物技术有限公司)提取基因组DNA,提取的DNA用紫外线分光光度仪进行质量测定，吸光度值为1.7～1.9。引物和探针购自美国AB公司。PCR反应体系为25 μL，内含：Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)12.5 μL，20×Taqman SNP Genotyping Assay Mix(一条FAM标记SNP位点的MGB探针，标记A，发红色荧光;一条VIC标记SNP位点的MGB探针，标记G，发绿色荧光;外加一对引物;Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)1.25 μL, 10 mg/L的基因组DNA4 μL,超纯水5.25 μL。在RotorGene RG3000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett　Research公司)上反应：95 ℃ 10 min(激活Mix里的金牌DNA扩增酶，使其暴露活性中心，降低非特异性扩增); 继而 92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 进行48个循环。仪器自动收集荧光信号，SDS软件分析并给出SNP分型结果。为了保证基因分型的准确性，随机挑选20例(21%)标本由另一操作者进行重复实验，结果与第一次完全一致。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS 16.0 for Windows软件进行统计学处理，χ2检验及Fisher精确检验比较各基因型在不同疗效组的分布差异，表示各种基因型与化疗敏感性的关系,并经Logistic 回归模型计算OR及95%CI;用Kaplanmeier法计算生存率,用Logrank检验比较不同基因型的TTP差异,Cox比例风险模型评估各可能的影响因素对实验结果的影响,并计算OR及95%CI。所有检验的P值均为双尾，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 基因分型

　　在94例晚期胃癌病人中， 51例(54.26%)携带XRCC1 399 G/G基因型，35例(37.24%) 携带A/G基因型，8例(8.50%)携带A/A基因型，3组基因型分布差异无显著性(χ2=0.319，P>0.05)，符合HardyWeinberg遗传平衡规律，因此该人群具有代表性。

　　2.2 XRCC1基因型与化疗敏感性关系

　　60例Ⅳ期胃癌病人化疗后，CR者0例，PR者18例，SD者24例，PD者18例，临床获益率为70%。因XRCC1 第399位密码子A/A基因型病人例数过少，将其与A/G基因型合并。结果显示，XRCC1基因Arg399Gln基因型G/G、A/G+A/A在化疗敏感组与化疗不敏感组中的分布频率差异有显著意义(χ2=6.747,P<0.05;OR=4.680，95%CI=1.397～15.682,P=0.009)。经Logistic回归分析，此组病人的性别、分化、转移灶数目、年龄、PS评分与化疗敏感性之间不相关，XRCC1基因型与化疗敏感性明显相关。见表1。表1 XRCC1基因型与胃癌化疗敏感性关系基因型化疗结果(略)

　　2.3 XRCC1基因型与生存期关系

　　94例病人中位TTP为9.0个月，G/G基因型中位TTP为10.5个月，A/G+A/A中位TTP为7.0个月，两者比较差异有显著性(χ2=7.113,P<0.01)。Cox 比例风险模型分析结果显示，XRCC1基因型是TTP的独立影响因素。见表2。表2 XRCC1基因多态性与TTP关系(略)

　　3 讨论

　　尽管各种早期检测手段在胃癌的诊断中已得到应用，但超过一半的胃癌在确诊时已属晚期，仍需进行放化疗。随着分子生物学发展，对胃癌的病因、发生机制及治疗效果的深入研究，认为人体细胞某些基因结构和功能的异常是胃癌发生发展、转归及预后的更深层次原因。XRCC1是参与DNA损伤修复且与铂类药物抵抗有关的重要因子。XRCC1可直接与DNA聚合酶β、DNA 连接酶Ⅲ和多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶(PARP)形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复, 对维持基因的稳定性发挥十分关键的作用[4]。流行病学调查发现，XRCC1基因多态性与肺癌[5]、结肠癌[6]等多种肿瘤患病风险增加有关。 但是也有相反的报道结果,认为XRCC1第399位密码子精氨酸(Arg)→谷氨酰胺(Gln)的多态性可降低肿瘤患病风险[7]。

　　奥沙利铂是一种极为稳定的配合物，通过产生烷化结合物而损伤DNA，阻断其复制和转录。损伤后的DNA如能及时修复就会导致奥沙利铂耐药。因此,个体DNA损伤修复能力的差异可能是决定铂类药物疗效的重要因素[8]。XRCC1基因10号外显子上399位密码子G→A的多态导致氨基酸残基的替代，改变了对DNA损伤修复的效能，影响奥沙利铂治疗的效果。含铂类药物的联合化疗方案是最常用的胃癌化疗方案之一,但不同个体对铂类药物敏感性差异很大,从而影响这类药物的临床疗效。有文献检测了102例接受FOLFOX方案辅助化疗胃癌病人，其中携带A/A基因型的病人无复发生存期和总生存期均显著优于携带A/G和G /G基因型病人(P<0.05)。国外KEAM等[9]和RUZZO等[10]研究未显示，XRCC1 399A/G 多态性与化疗反应率及生存期明显相关。

　　本研究采用改良FOLFOX4或Xelox方案治疗晚期胃癌病人94例，将Ⅳ期60例病人分为化疗敏感组与化疗不敏感组,近期总临床获益率为70%。XRCC1基因Arg399Gln 的多态基因型G/G与A/G+A/A合并基因型在化疗敏感组中分别为27例(84.38%)、5例(15.62%)，而在化疗不敏感病人中分别为15例(53.57%)、13例(46.43%)，两组间比较差异有显著性。携带G/G基因型的个体化疗敏感性是A/G+A/A基因型的3.250倍(95%CI为1.018～10.379，P<0.05)。94例病人中位TTP为9.0个月，G/G基因型为10.5个月，A/G+A/A基因型为7.0个月，两者比较差异有显著性。提示XRCC1第399位密码子基因型与晚期胃癌对含奥沙利铂方案的化疗敏感性和近期生存期相关。

　　肿瘤治疗的最终目标是通过对肿瘤病人的基因检测,在获得药物效应相关基因的基因型和表型资料的基础上,充分考虑到化疗药物的反应性和毒性,实施个体化治疗。遗传药理学分析是个体化化疗的另一途径,药物代谢酶系统的遗传变异是决定疗效的一个主要因素。基于相关的药物代谢酶的基因型或表型的个体化治疗是今后化疗的方向，目前在临床上一般通过聚合酶链反应(PCR) 和限制性片段长度多态性(RFLP)分析来筛选药物代谢酶的基因型。本文采用TaqManMGB探针等位基因分型技术检测病人的基因型，具有方法简便、快速，灵敏度、特异性高，省时省力、不易污染的优点。本实验是从外周血中提取DNA，而非从瘤内获取，虽然目前尚无关于肿瘤细胞内和非肿瘤细胞内DNA修复能力的关系的研究，但是有文献认为非瘤细胞内的DNA修复能力仍可以影响肿瘤的化疗效果，且同样呈负相关[11]。取用外周血方便简捷，可以克服未手术治疗,特别是晚期病人不能手术取得标本的困难。随着人类基因组计划的实施, 一些新技术如基因芯片也用来筛选药物代谢酶的基因型和检测受体表达的多样性。总之, 在给药前对病人进行遗传药理学筛选, 可以预测个体的药物敏感性, 从而制定有效的个体化治疗方案。

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