血浆同型半胱氨酸、血清叶酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与结、直肠癌发病关系的研究

　　作者：朱凡,王毓明,张勤英 作者单位：(苏州市立医院北区 肿瘤内科,江苏 苏州 215008)

　　【摘要】 目的:研究血浆同型半胱氨酸、血清叶酸及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与结、直肠癌发病的关系。方法：采用PCRRELP技术检测了216例结、直肠癌患者和111名健康人的MTHFR C677T及A1298C两个位点基因多态,血浆同型半胱氨酸和血清叶酸水平分别采用HPLC方法与96孔板微生物学法测定,并分析其与结、直肠癌的关系。结果：MTHFR C677T的CC、CT和TT基因在健康对照组中的分布频率分别为45.04%、47.74%和7.2%,结、直肠癌组为40.74%、47.2%和12.03%,病例组中TT基因显著高于对照组(χ2=7.81,P<0.05)。MTHFR A1298C的AA和AC基因在健康对照组分布频率分别为45.04%和54.95%,结、直肠癌组为48.8%和53.12%,MTHFR A1298C等位基因在两组人群分布频率的差异无统计学意义(χ2=0.56,P=0.450 0)。结、直肠癌患者中拥有TT基因者其血浆总同型半胱氨酸水平显著高于携带CC和CT基因者[分别为(16.12±9.03)、(11.43±4.08)μmol·L-1,P=0.002],对照组中TT基因者其血浆总同型半胱氨酸浓度显著低于携带CC和CT基因者。结、直肠癌患者中拥有TT基因者其血清叶酸水平显著低于携带CC和CT基因者[分别为(4.54±2.78)、(6.86±2.03)mg·ml-1,P<0.05],对照组中TT基因者其血清叶酸浓度也显著低于携带CC和CT基因者。结论：MTHFR C677T位点多态性与高同型半胱氨酸、低血清叶酸在结、直肠癌发病过程中起一定作用。

　　【关键词】 血浆同型半胱氨酸; 血清叶酸; 亚甲基四氢叶酸还原酶基因; 结肠肿瘤; 直肠肿瘤

　　A casecontrol study of plasma homocysteine, serum folate, the polymorphismof methylenetetrahydrofolate reductase in colorectal cancer

　　ZHU Fan, WANG Yuming, ZHANG Qinying(Department of Oncology, Suzhou Municipal Hospital(North Area), Suzhou 215008, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the relationship between the plasma homocysteine,serum folate and methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) polymorphism and the coloretal cancer susceptibility. Methods: 216 patients with colorectal cancer and 111 healthy controls were conducted in this study. MTHFR C677T and A1298C polymorphisms were analyzed by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism(PCRRFLP)methods. Plasma total homocysteine and serum folate were measured by HPLC and 96wall microbiological assay respectively. Results: The frequencies of CC, CT and TT in MTHFR C677T allels were 45.04%, 47.74% and 7.2% in healthy controls and 40.74%, 47.2% and 12.03% in colorectal cancer group,respectively. There was a significant difference of the frequency of TT allele between them(χ2=7.81, P<0.05). Plasma total homocysteine level was statistically higher in cancer patients carrying TT genotype than that in patients carrying CC and CT genotype[(16.12±9.03), (11.43±4.08)μmol·L-1, respectively, P=0.002)], and serum folate was lower in cancer patients carrying TT genotype than that in patients carrying CC and CT genotype[(4.54±2.78), (6.86±2.03)mg·ml-1, respectively, P<0.05)]. Conclusion: MTHFR C677T polymorphism, higher concentration of plasma homocysteine and lower serum folate might serve as the risk factors of colorectal cancer.

　　[Key words] plasma homocysteine; serum folate; methylenetetrahydrofolate reductase; coloretal cancer

　　结、直肠癌是最常见的消化道肿瘤,在美国每年约有55 000例新增结、直肠癌症患者,在我国每年约有14万例新增患者[1]。结、直肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程。有报道低叶酸、低蛋氨酸、高同型半胱氨酸(Hcy)及其它甲基团拮抗剂等能增加结、直肠癌的危险[2]。同型半胱氨酸与肿瘤的关系已引起了广泛的注意,各种肿瘤患者均可见到血浆同型半胱氨酸升高,如肝癌,结、直肠癌及妇科肿瘤。我们曾观察到消化道肿瘤患者血浆同型半胱氨酸明显增高,胃癌,食管癌,结、直肠癌及肝癌患者与正常对照者之间血浆同型半胱氨酸水平之间的差异极为显著[3]。

　　叶酸及其辅酶对所有活细胞的生长发育等功能都有重要的影响。同时,叶酸还对核酸的合成以及DNA、RNA、蛋白与磷脂分子的生物学甲基化有重要的影响[4]。叶酸缺乏可影响DNA甲基化、DNA整合以及DNA修复[5],从而改变肿瘤抑制基因的表达而增加了肿瘤的形成。我们以往的研究发现,结、直肠癌患者的叶酸水平显著低于正常人[3]。这表明结、直肠癌与叶酸缺乏之间存在着一定的联系,值得进一步研究。

　　近年来国外报道,亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性在结、直肠癌的发病中也起了重要的作用。MTHFR基因多态性与宫颈癌的易感性有关,并是与晚期结、直肠癌病人转归有关的主要和独立的因素[6],而且支持一碳基团代谢在结、直肠癌的发病中起重要作用的假设。本研究旨在通过对结、直肠癌患者及年龄配对人群的血浆同型半胱氨酸、血浆叶酸和MTHFR基因多态性的调查,了解其与结、直肠癌发病的关系。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　自2004年1月至2007年12月随机收集经病理学确诊的结、直肠癌症患者216例,其中男114例,女102例;对照组111名,其中男62名,女49名,为年龄及性别配对的健康正常人,系从苏州市体检中心随机抽样取得,均排除肿瘤疾患。

　　1.2 MTHFR C677T及A1298C位点多态性基因型分析 收集静脉血5 ml,枸橼酸钠抗凝,用QIAamp DNA Blood kit提取全血中的DNA,OD260 nm/OD280 nm值在1.6～2.0认为DNA可用于后续基因多态性分析。

　　1.3 研究方法

　　用PCRRFLP研究MTHFR基因C677T多态性,所用引物为：5′TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA3′和5′AGGACGGTGCGGTGAGAGTG3′。PCR反应体系组成为：DNA(QIAamp DNA Blood kit, Qiagen)50 ng、PrimeStar Taq(TaKaRa)0.5 μl、5×buffer 10 μl、dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μl、左引物(50 pmol·μl-1)0.5 μl、右引物(50 pmol·μl-1)0.5 μl,用去离子水补足总体积50 μl。PCR程序：95 ℃预变性3 min;94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s,循环30次(M J Research PCR仪)。PCR产物电泳后割胶回收(QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen),用HinfⅠ内切酶在37 ℃消化1 h,用2%琼脂糖凝胶分离,GelRed(Biotium Inc)染色确定MTHFR C677T基因(野生型纯合子：CC; 杂合子：CT; 变异性纯合子：TT)。

　　同样用PCRRFLP技术研究MTHFR基因A1298C多态性,上游引物:5′CTTTGGGGACTGAAGGAC3′,下游引物:5′CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG3′。PCR反应液组成为：DNA 25 ng、PrimeStar Taq(TaKaRa)0.25 μl、5×buffer 5 μl、dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μl、上游引物(50 nmol·L-1)0.25 μl、下游引物(50 nmol·L-1)0.25 μl、用去离子水补足至25 μl。PCR程序为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循环30次(M J Research PCR仪)。PCR产物电泳后割胶回收(QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen),用MboⅡ内切酶在37 ℃消化1 h,用3%琼脂糖凝胶分离,GelRed(Biotium Inc.)染色确定MTHFR A1298C基因型。

　　1.4 血浆Hcy的测定

　　采用高效液相色谱方法[7],空腹抽取静脉血5 ml,置于Na2EDTA试管中待检。测定采用岛津LC9A高效液相色谱仪,分析柱为ODS C18(5 μm)(250 mm×4.6 mm),荧光检测仪为岛津FR535型;激发波长为358 nm,发射波长为515 nm,流动相为0.1 mol·L-1磷酸二氢钾(以正磷酸调至pH2.1,含有10%乙晴)。血浆叶酸测定：采用96孔板微生物学方法测定,叶酸测定试剂菌种由DPC公司提供。

　　1.5 统计学处理

　　分别计算两组的MTHFR C677T和A1298C等位基因的分布情况,组间的差异采用四格表χ2检验,基因型与结直肠癌风险的调整OR值及其95%可信区间(CI)采用非条件Logistic回归模型拟合,所有统计学分析均采用SPSS11.0软件。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况

　　结、直肠癌组的年龄、性别、饮酒及吸烟状况与对照组在构成比上的差异无统计学意义(表1)。表1 结、直肠癌组与对照组年龄性别与饮酒状态注：括号内为相应百分比

　　2.2 MTHFR基因多态与结、直肠癌的关联分析

　　在111名健康对照组中MTHFR C677T的CC、CT和TT基因型分布分别为45.04%、47.74%和7.2%,其分布符合HardyWeinberg平衡定率的预计(P=0.265)。结、直肠癌组为40.74%、47.2%和12.03%,病例组中TT基因型显著高于对照组(χ2=7.81,P<0.05)。对照组A1298C的AA和AC基因分布频率分别为45.04%和54.95%,分布符合HardyWeinberg平衡定率的预计(P=0.800 0);病例组为48.8%和53.12%,MTHFR A1298C等位基因在两组人群分布频率的差异无统计学意义(χ2=0.56,P=0.450 0)。见表2。表2 MTHFR C677T基因型分布及其与结、直肠癌易感性的关系例注：括号内为相应的百分比

　　2.3 血浆同型半胱氨酸和叶酸水平与MTHFR C677T及A1298C基因型的关系 血浆同型半胱氨酸和叶酸水平与MTHFR C677T及A1298C基因型的关系见表3、4。从表3可以看出结、直肠癌患者中有MTHFR C677T等位基因拥有TT基因者,其总同型半胱氨酸水平显著高于携带CC和CT基因者[分别为(16.12±9.03)和(11.43±4.08)μmol·L-1,P=0.002];而CC和CT基因组间总同型半胱氨酸水平差异无统计学意义(P=0.56)。对照组中TT基因者其总同型半胱氨酸水平也显著高于携带CC和CT基因者;结、直肠癌患者和对照组中TT基因携带者之间,其总同型半胱氨酸水平差异无统计学意义。结、直肠癌患者与对照组CC和CT基因携带者血浆同型半胱氨酸水平之间的差异有统计学意义,分别为(8.81±2.15)、(11.43±4.08)μmol·L-1,P<0.01。从表4可以看出结、直肠癌患者中拥有TT基因者其血浆叶酸水平显著低于携带CC和CT基因者[分别为(4.54±2.78)、(6.86±2.03)mg·ml-1,P<0.05],对照组中TT基因者其血浆叶酸浓度也显著低于携带CC和CT基因者。结、直肠癌患者与对照组拥有TT基因者其血浆叶酸及血浆同型半胱氨酸水平无显著性差异。另外,在结、直肠癌组和对照组不同A1298C等位基因亚组,其血浆叶酸及血浆同型半胱氨酸水平的差异均无统计学意义。表3 血浆同型半胱氨酸水平与MTHFR C677T及A1298C基因型的关系与对照组相比,a P<0.05;与CC及CT相比,b P=0.002注：括号内为病例数表4 血浆叶酸水平与MTHFR C677T及A1298C基因型的关系注：括号内为病例数

　　3 讨 论

　　MTHFR C677T是一个常见的不耐热错义突变,MTHFR基因第677位密码子C被T置换,从而使一个高度保守的丙氨酸(Ala)变成了颉氨酸(Vla)。该多态被认为在叶酸结合区,可使该酶的活性下降1/3,增加酶的热不稳定性,使胞浆中叶酸含量下降,半胱氨酸含量增加。Frosst报道,正常的CC纯合子活性为100%,CT为65%,而TT仅有30%的活性[8]。MTHFR C677T突变基因在人群中呈多态分布,在全世界有相对较高的突变频率,与欧洲(24%～40%)和亚洲(2.5%～33%)相比,非洲人群中T等位基因频率最低(4.9%～9%)。中国人中C677T的频率为41%[9]。MTHFR另一个常见的多态是A1298C,该多态也能使MTHFR活性下降,同时和C677T之间存在联合作用。MTHFR A1298C突变基因在人群中的分布也各异,日本人、高加索人和夏威夷人分别为21%、30.7%和23.0%,中国人频率为16.5%左右[10]。本次研究MTHFR C677T和A1298C突变基因的频率和以往报道的结果基本一致。

　　同型半胱氨酸与肿瘤的关系已引起了广泛的注意。文献报道Hcy引起细胞癌变可能与同型半胱氨酸硫内酯的形成及其毒性有关。现已明确，同型半胱氨酸硫内酯可造成细胞增殖性改变,如纤维化、血管形成、胶原性炎症、钙化、血管内栓塞、鳞状上皮化增生、伴有角质化及上皮不典型增生。对内皮细胞体外的研究发现，Hcy可促使过氧化氢形成,抑制内皮细胞呼吸,而导致内皮细胞损伤并能刺激平滑肌细胞增殖。另外,Hcy还与细胞内DNA多胺、组蛋白等有关[11]。本研究发现，结、直肠癌患者中MTHFR C677T携带T/T基因者,其Hcy水平显著高于携带CC及CT基因者,这与Sandra的报道一致,在另一组结、直肠癌患者中也发现了这一情况。所以我们认为这并非单纯与MTHFR酶的活性减少有关,还涉及较为复杂的叶酸代谢紊乱,并与结、直肠肿瘤细胞的蛋氨酸依赖性增殖率有关[12]。

　　叶酸及其辅酶对活性细胞的生长发育等功能有重要的影响,还对核酸的合成以及DNA、RNA、蛋白与磷脂分子的生物学甲基化有重要的影响。本研究血浆叶酸测定结果表明，MTHFR C677T携带TT基因者血清叶酸水平显著低于携带CC和CT基因者。流行病学调查证实低甲基饮食(低叶酸、低蛋氨酸、高酒精)是结、直肠癌的危险因素。国外对89 000位女性的研究发现，增加叶酸摄入,能降低结、直肠癌的危险性。一些富含叶酸的蔬菜、水果等与结、直肠癌的风险呈负相关[13-14]。经Meta分析,C677T和结、直肠癌易感性的综合OR为0.77(95%CI:0.64～0.93),有显著统计学意义(P=0.006)[15]。我们的研究未发现A1298C基因多态性与结、直肠癌易感性之间有关。

　　同型半胱氨酸增高并非单纯因MTHFR酶活性减少所致,而与更为复杂的叶酸代谢紊乱有关,可能部分与结、直肠癌细胞蛋氨酸依赖性增殖率有关。现已了解大多数癌细胞包括结、直肠癌细胞的培养需要蛋氨酸,但来自同型半胱氨酸的内源性蛋氨酸的转化,并不能满足细胞代谢的需求[16]。四氢叶酸甲基转移酶反应中作为辅因子的叶酸缺乏可导致癌细胞内蛋氨酸合成不足。增殖细胞内需求增加的叶酸可通过一些途径如嘌呤与嘧啶合成丢失,分化细胞内同型半胱氨酸增高,而导致叶酸从这些细胞内丢失,因此高水平的同型半胱氨酸可能是癌基因表达及癌细胞活性的标记。由于同型半胱氨酸代谢分配伴有叶酸缺乏[17],现已发现与血浆叶酸相比,同型半胱氨酸的升高是细胞内叶酸缺乏更为敏感的指标。Kim等[18]发现结肠黏膜叶酸浓度与血浆叶酸及同型半胱氨酸浓度相关。MTHFR基因变异导致了作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍,进而导致了DNA的低甲基化。细胞基因组DNA的去甲基化可能与细胞的过度增殖有关。细胞DNA(特别是有关基因表达控制点)的甲基化水平对基因表达起调节作用,甲基化水平降低,相关基因的转录水平就增高[19]。有报道结、直肠癌患者的总体DNA的甲基化水平分别较正常黏膜低8%和10%,特定原癌基因如cHaras及cKiras基因也呈低甲基化状态[20]。这也提示MTHFR基因多态性可能与癌症的发生有关。

　　本研究结、直肠癌组与对照组中TT基因携带者血浆同型半胱氨酸浓度同样升高,提示TT基因对血浆同型半胱氨酸有较强的影响。已报道MTHFR C677T基因多态性与结、直肠癌危险性增加有关。我们的观察表明TT基因携带者血清叶酸水平减少,也就减少了对结、直肠癌危险的保护作用,但本研究涉及样本数相对较小,而且仅为苏州地区,尚不能排除抽样误差,今后需要对更大样本及较大地域范围的人群作进一步调查。

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