βcatenin依赖性 LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响

　　作者：王淑红，南克俊，田 涛，梁 璇 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤内科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨βcatenin依赖性LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响。方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF1的编码基因，插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5His中，脂质体法转染Hela细胞，G418筛选稳定表达目的基因的细胞株，Western blot鉴定目的基因的表达，MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况，Annexin V方法检测细胞凋亡情况，裸鼠体内成瘤实验检测βcatenin依赖性LEF1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。结果 成功构建LEF1真核表达质粒，获得稳定表达βcatenin依赖性LEF1亚型的HeLa细胞株，转染后的细胞增殖速度加快，凋亡水平降低，体内成瘤能力加强。结论 全长型LEF亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用。

　　【关键词】 LEF1;增殖;凋亡;宫颈癌

　　Effects of βcatenindependent LEF1 isoforms

　　on the biological behavior of HeLa cellsWANG Shuhong, NAN Kejun, TIAN Tao, LIANG Xuan

　　(Department of Oncology, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)ABSTRACT: Objective To study the effects of βcatenindependent lymphoid enhancer factor (LEF1) isoforms on biological behavior of HeLa cells. Methods βcatenindependent LEF1 genes were obtained by PCR from human lymphoid node cDNA library and inserted into pcDNA3.1/V5His vector to construct the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1FLEF1. Using lipofectamineTM 2000, the plasmid pcDNA3.1FLEF1 was transfected into Hela cells. Then we screened the stable cell lines that expressed the truncated LEF1 isoforms by G418 and identified the expression of target gene with Western blot. Then we analyzed the proliferation, apoptosis, cell clone formation and capability of tumor formation in vivo of transfected cell lines. Results We successfully constructed the βcatenindependent LEF1 eukaryotic expression plasmid and obtained the stable HeLa cell lines that expressed the fulllength LEF1 isoforms. The proliferation and capability of tumor formation in vivo of transfected cells were increased while apoptosis was decreased. Conclusion The overexpression of βcatenindependent isoforms can stimulate the malignant biological behavior of HeLa cells.

　　KEY WORDS: lymphoid enhancer factor (LEF1); proliferation; apoptosis; uterine cervix cancer

　　淋巴细胞增强因子(lymphoid enhancer factor, LEF1)最初是JONES和他的同事从Jurkat细胞中分离得到的，并进行了氨基酸测序[1]。LEF1是一种Wnt信号通路中的关键因子，由于LEF1基因剔除小鼠会发生胚胎性致死[2]，因此，LEF1被认为在胚胎发育过程中发挥重要作用。目前的研究表明LEF1至少存在两种以上的亚型[34]，其中βcatenin依赖性LEF1亚型，即全长型LEF1，通过和βcatenin结合募集转录共激活物，继而激活下游靶基因。LEF1在许多动物的胚胎组织细胞中高表达。但是，在个体出生以后其表达量迅速下降[5]。现有报道[2]显示在某些肿瘤和肿瘤细胞株又能重新检测到LEF1的表达，且全部是全长型，其具体机制还不是很明确。本研究通过构建稳定表达全长型LEF1的HeLa细胞株，探讨βcatenin依赖性 LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响，为临床肿瘤的防治提供一定理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 大肠杆菌XL10、人淋巴结cDNA文库、质粒载体pcDNA3.1/V5His、HeLa细胞为本室保存。载体pMD18T购自TaKaRa公司;脂质体LipofectamineTM 2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公司;鼠抗人LEF1单克隆抗体购自Chemicon公司;鼠抗人βactin单克隆抗体、羊抗鼠二抗均购自北京中杉试剂公司;MTT、DMSO购自Sigma公司;AnnexinV凋亡检测试剂盒购自BD公司;细胞培养试剂购自Gibicol公司;G418购自罗氏公司;去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;DNA胶回收试剂盒、PCR试剂盒、各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司。根据GenBank提供LEF1 mRNA序列(NM016269)设计LEF1截短体引物：上游5′CACAGCGGAGCGGAGATTACA3′;下游5′AAT

　　GAGCTTCGTTTTCCACCATG3′。

　　1.2 全长型LEF1真核表达载体的构建 以人淋巴结cDNA文库为模板PCR扩增全长型LEF1开放阅读框。50μL PCR体系为：1μL模板，5μL PCR缓冲液，5μL dNTP，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL rTaq酶，余用高压灭菌的去离子水补齐至50μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃末次循环7min。将PCR产物克隆到pMD18T载体中，BglⅡ和EcoRⅠ双酶切鉴定，阳性克隆命名为TFLEF1，并将其送北京奥科生物有限公司测序。测序正确的TFLEF1及真核表达载体pcDNA3.1/V5His分别经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，胶回收所需要的片段，进行连接转化和扩增，最终获得全长型LEF1的真核表达质粒：pcDNA3.1FLEF1。得到的质粒用EcoRⅤ进行酶切鉴定。

　　1.3 G418筛选稳定表达目的基因的细胞株 转染前1d将2×105细胞接种于6孔板，LEF1真核表达质粒和对照质粒定量后按照Lipofectamin2000的说明书转染HeLa细胞。细胞转染后24h按1∶5传代，G418筛选(终浓度为800mg/L)阳性克隆，常规换液，直至有单克隆细胞集落形成。挑取单个细胞克隆，在含400mg/L的G418维持浓度的DMEM培养基中筛选扩增。Western blot鉴定目的基因表达。

　　1.4 Western blot检测目的基因LEF1的表达 提取转染后的稳定细胞株的总蛋白，Bradford法蛋白定量，SDSPAGE电泳，于25V稳压状态下转膜3h，室温用50g/L蛋白干粉封闭1h，小鼠抗人LEF1(1∶500)，4℃，孵育过夜，山羊抗小鼠二抗IgGHRP(1∶2000)室温作用1h，ECL化学发光显影。

　　1.5 MTT检测获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞的活性 将1×103转染后的稳定细胞株接种到96孔板，每孔体积200μL，每组设5个复孔，并设调零孔。分别在培养的第1、2、3、4、5d取出需测定的培养板，每孔加入MTT溶液(5g/L，用PBS配制，pH=7.4)20μL，继续孵育4h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

　　1.6 获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞克隆形成能力的检测 在60mm培养皿中接种1×103转染了含目的基因质粒及对照质粒的细胞，同时每组设3个复皿。按照常规细胞培养方法、每2～3d换液一次。14d后观察克隆形成，并进行Gimsa染色。弃去培养液，PBS轻柔漂洗2次，甲醇固定30min，弃去甲醇，PBS漂洗3次，加入Giemsa染液1mL(或充分铺满皿底)，染色15min，弃去染液，PBS漂洗2次，体视镜下计数(细胞克隆的标准为≥50个细胞的细胞团计数为一个克隆)并拍照。

　　1.7 Annexin V/PI检测获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞凋亡情况 将细胞以3×105/孔接种在6孔板中，37℃，50mL/L CO2恒温细胞孵箱中培养3d。用细胞刮轻柔将细胞刮下，将收集得到的细胞在预冷的PBS中洗涤2次，继而以1×106个细胞/mL的浓度在1×结合缓冲液中重悬。将1μL液体(1×105个细胞)转移至5mL的流式管中。分别加入5μL的Annexin VFITC和5μL的PI。轻柔重悬，室温避光染色15min。每管加入400μL的结合缓冲液，1h以内进行流式分析。

　　1.8 获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞裸鼠体内成瘤能力的检测 将6只BALB/cnude裸鼠随机分成两组，每组3只。将5×106转染后的稳定表达全长型LEF1的HeLa组细胞及对照组细胞分别注射于裸鼠的两侧腹部皮下，注意观察小鼠状态和肿瘤生长状况。注射15d后使用游标卡尺分别测量肿瘤的长径(L)和横径(S)，并做好记录，每3d测量一次。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积= L×S2×0.51。注射30d后，取出肿瘤观察大体形态并称重。

　　1.9 统计学处理 采用SPSS13.10统计软件进行统计学分析，结果用±s表示，两组之间比较进行t检验，P<0.05判定为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 全长型LEF1真核表达载体的构建 以人淋巴结cDNA文库为模板，PCR扩增截短型LEF1开放读框，得到大小为1257bp的PCR产物(图1A)，回收后插入载体pMD18T中，得到TFLEF1，用BglⅡ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，若为正向插入(头在HindⅢ侧)酶切得到大小约1140bp的片段，若为反向插入(尾在HindⅢ侧)酶切得到大小约170bp的片段(图1B)，将正向插入的克隆送北京奥克生物有限公司测序，结果证实与GenBank中的相对应部分序列完全一致。继而将TFLEF1以及真核表达载体pcDNA3.1/V5His经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切片段进行连接转化，最终得到全长型LEF1的真核表达质粒，经EcoRⅤ酶切鉴定，预期得到大小约680bp的片段，琼脂糖凝胶电泳显示与预期片段大小一致(图1C)，表明全长型LEF1真核表达载体pcDNA3.1FLEF1构建成功。

　　2.2 稳定表达全长型LEF1蛋白的HeLa细胞株的筛选 质粒pcDNA3.1FLEF1及对照质粒pcDNA3.1/V5His转染Hela细胞，经G418筛选后得到阳性克隆细胞株，Western blot检测目的基因的表达情况。结果显示目的基因稳定表达(图2)。

　　2.3 MMT检测全长型LEF1对HeLa细胞增殖的影响 MTT检测转染后细胞的生长情况，并以时间为横轴，490nm处吸光值为纵轴绘制了生长曲线(图3)。结果显示转染了全长型LEF1的HeLa细胞生长速度，增殖能力较对照组明显增强(P<0.05)，有统计学差异。

　　2.4 Annexin VFITC/PI检测全长型LEF1对HeLa细胞凋亡的影响 Annexin VFITC/PI染色检测转染后细胞的凋亡情况，Annexin V阳性细胞即发生凋亡的细胞，转染了全长型LEF1的细胞凋亡细胞的比例为(7.15±1.62)%，对照组凋亡细胞比例为(13.18±1.48)%，转染了全长型LEF1的细胞的凋亡能力下降(P<0.05，n=3)(图4)。

　　图3 MMT检测全长型LEF1对HeLa细胞增殖的影响

　　Fig.3 The effect of full length isoforms LEF1 on the proliferation of HeLa cells (P<0.05，n=5)

　　2.5 全长型LEF1对HeLa细胞克隆形成能力的影响 比较转染后细胞的克隆形成情况，转染了全长LEF1质粒的HeLa细胞组形成的克隆体积大，数目多(图5A)，克隆形成率为(68.3±7.6)%(图5B)，而转染了对照质粒的HeLa细胞组克隆形成率为(37.3±6.4)%，形成的克隆体积小，数目少。结果显示获得性表达全长型LEF1后HeLa细胞的克隆生成能力增强(P<0.05，n=3)。

　　2.6 全长型LEF1对HeLa细胞裸鼠体内成瘤能力的影响 将转染后稳定表达全长型LEF1及对照质粒蛋白的HeLa细胞注射于裸鼠两侧腹部皮下，注射后每天观察肿瘤的生长状况，15d后接种部位肉眼可见肿瘤生成，对肿瘤的长径和短径进行测量，每3d测量一次，所绘制的肿瘤生长曲线显示，在裸鼠身上接种的转染了全长型LEF1 HeLa细胞较对照组形成肿瘤的速度快(图6A)。注射后30d取出肿瘤组织观察大体形态(图6B)，并称重，接种的转染了全长型LEF1HeLa细胞所形成的肿瘤的体积和重量大于对照组(图6C)(P<0.05)，具有统计学差异，提示全长型LEF1刺激肿瘤的生长。

　　3 讨 论

　　LEF/TCF是一类含HMG盒(high mobility group)的转录因子家族。LEF/TCF的HMG DNA结合域，位于其蛋白分子的C末端，包括一个HMG盒和一个核定位信号。βcatenin结合域是LEF/TCF家族分子的另一个保守结构域，它位于LEF/TCF的N末端。一般认为βcatenin通过Arm重复序列与LEF/TCF家族成员结合形成βcateninLEF/TCF异二聚体，使HMG盒与DNA 结合特性发生改变，进而使HMG盒与特异性靶基因的调控序列相互作用而活化靶基因的转录[3]。βcatenin具有有效的转录激活结构域，LEF/TCF自身没有激活作用，而是通过和βcatenin结合发挥激活靶基因的作用。在Wnt信号缺失的情况下，LEF/TCF和Groucho/Grg/TLE形成复合物对转录起抑制作用[67]，βcatenin则可以将Groucho从LEF/TCF分子上置换下来，并与其N末端结合而激活下游靶基因[8]。βcatenin/LEF/TCF复合物已经被认为具有癌基因的作用，阻止结肠癌细胞中LEF/TCFs和βcatenin的结合，则可以明显抑制肿瘤细胞的生长，但研究表明只有全长型LEF/TCFs才能发挥这种作用[910]。这和我们的研究结果一致。获得性表达全长型LEF1后的HeLa细胞增殖和存活能力明显增强，而凋亡降低。

　　肿瘤的持续生长不仅仅是过度增殖的结果，同时伴随的是肿瘤细胞凋亡的减少，而这种减少往往是相对于增殖过快而言的。但是，在我们的研究中，全长型LEF1不仅促进了宫颈癌细胞的增殖，同时抑制了它的凋亡，从正反两方面加速了细胞的生长，提示过表达全长型LEF1后细胞拥有更高的恶性程度。而克隆形成实验结果恰好印证了这一点，与转染了对照质粒的细胞相比较，转染了全长型LEF1基因的细胞的克隆形成能力增强。细胞克隆形成实验反映的不仅仅是细胞的增殖能力，它还反映了细胞之间生长的依赖性，间接提示了肿瘤细胞的恶性程度[11]。

　　无胸腺小鼠(裸鼠)可进行人体肿瘤异种移植，由于在裸鼠体内移植的人体肿瘤仍保留其原有的组织学形态、免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药物原有的敏感性，因而被认为是一种较为理想的体内实验模型[12]。我们将转染后的细胞接种在裸鼠腹部皮下，观察肿瘤的生长状况，测量其长径和短径并绘制了生长曲线，待接种一个月后，取出肿瘤观察大体形态并称重，结果显示转染了全长型LEF1基因的细胞较对照组体内成瘤能力增强。这和体外观察到的结果一致。过表达全长型LEF1可以促进HeLa细胞的恶性生物学行为。研究表明cMyc是Wnt信号的靶基因之一[13]。它作为一个癌基因，异常激活可以促进细胞分裂，促使细胞无限增殖，导致细胞恶性转化。因此，全长型LEF1促使细胞增殖加强、凋亡减少可能也是由于全长型LEF1的过表达使cMyc表达水平相应提高的结果。

　　总之，全长型LEF1基因在肿瘤细胞中的重新表达是细胞恶性转化的一个信号。它通过和βcatenin结合持续激活Wnt信号途径，继而激活一系列的靶基因来影响细胞的增殖和凋亡调控，从而参与肿瘤的发生发展过程。

　　【参考文献】

　　[1]RAVINDRANATH A, OCONNELL A, JOHNSTON PG, et al. The role of LEF/TCF factors in neoplastic transformation [J]. Curr Mol Med, 2008, 8(1):3850.

　　[2]ROOSE J, CLEVERS H. TCF transcription factors:molecular switches in carcinogenesis [J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 424(23):M2337.

　　[3]WATERMAN ML. Lymphoid enhancer factor/T cell factor expression in colorectal cancer [J]. Cancer Metastasis Rev, 2004, 23(12):4152.

　　[4]JESSE S, KOENIG A, ELLENRIEDER V, et al. Lef1 isoforms regulate different target genes and reduce cellular adhesion [J]. Int J Cancer, 2009, [in press]

　　[5]KORINEK V, BARKER N, WILLERT K, et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/betacatenin signaling during embryogenesis in the mouse [J]. Mol Cell Biol, 1998, 18(3):12481256.

　　[6]ARCE L, PATE KT, WATERMAN ML. Groucho binds two conserved regions of LEF1 for HDACdependent repression [J]. BMC Cancer, 2009, 9(1):159.

　　[7]HUANG H, HE X. Wnt/betacatenin signaling:new (and old) players and new insights [J]. Curr Opin Cell Biol, 2008, 20(2):119125.

　　[8]DANIELS DL, WEIS WI. Betacatenin directly displaces Groucho/TLE repressors from Tcf/Lef in Wntmediated transcription activation [J]. Nat Struct Mol Biol, 2005, 12(4):364371.

　　[9]LI TW, TING JH, YOKOYAMA NN, et al. Wnt activation and alternative promoter repression of LEF1 in colon cancer [J]. Mol Cell Biol, 2006, 26(14):52845299.

　　[10]POLAKIS P. The many ways of Wnt in cancer [J]. Curr Opin Genet, 2007, 17(1):4551.

　　[11]PARRIS GE. The role of viruses in cell fusion and its importance to evolution, invasion and metastasis of cancer clones [J]. Med Hypotheses, 2005, 64(5):10111014.

　　[12]司徒镇强，吴军正. 细胞培养 [M]. 第1版. 西安：世界图书出版社，1996:142143.

　　[13]LIU GY, LUO Q, XIONG B, et al. Tissue array for Tp53, Cmyc, CCND1 gene overexpression in different tumors [J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(47):71997207.