茅莓总皂苷体外抗肿瘤作用研究
发表时间：2010-05-18 浏览次数：451次
作者：郑振 张玲菊 黄常新 黄巧玲 尉晓冬 叶建根 作者单位：310009 杭州市第三人民医院(郑振) 310006 浙江大学医学院附属第一医院(张玲菊 黄常新 黄巧玲 尉晓东 叶建根)
关键字：茅莓总皂苷体外抗肿瘤作用研究
茅莓(Rubus parviflolius L.)，别名天青地白草、红梅消、三月泡，为蔷薇科悬钩子植物，具有活血化瘀，清热解毒等作用。本研究选择了HR8348直肠腺癌细胞、A375黑色素瘤细胞、Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤细胞和A431人表皮癌细胞为癌细胞株，用茅莓总皂苷对它们进行体外抗肿瘤试验,同时检测了茅莓总皂苷对HR8348直肠腺癌周期的影响，结果显示对前三种肿瘤有良好的抗肿瘤活性，通过将细胞周期阻滞在S期在而发挥抗肿瘤作用。
1 材料与方法
1.1 茅莓总皂苷
茅莓总皂苷由浙江省中医药研究院提取。实验所用高中低三种浓度分别为1mg%、0.1mg%和0.01mg%。
1.2 细胞株
HR8348直肠腺癌细胞、A375黑色素细胞瘤细胞、Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤细胞和A431人表皮癌细胞(均购自中国科学院上海细胞生物研究所)。
1.3 主要药品与试剂
茅莓总皂苷，环磷酰胺;多聚甲醛AR;RPMI 1640粉末，使用时按要求配制成培养液，并加入10%灭活小牛血清和100μg链霉素;胰蛋白酶，使用时用pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.25%的溶液;MTT(噻唑兰)，DMSO(二甲基亚砜);胎牛血清(FBS);乙二胺四乙酸(EDTA，美国Sigma公司);PBS(每1000ml含8gNaCl,0.2gKCl,1.44gNa2HPO4,0.24gKH2PO4);8分光光度检测试剂盒。
1.4 主要仪器
超净工作台，IX-70型倒置显微镜，HF151UV CO2培养箱，BASO2002-2型离心机，Wellscan MK3型酶标仪。流式细胞仪FACS Calibur。
1.5 体外抑瘤实验(MTT法)
将A375人恶性黑色素瘤细胞、HR8348结肠癌细胞、A431表皮癌细胞和Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤细胞分别与0.25%胰酶、0.02%EDTA混合消化后计数调节细胞为1×105/ml，于96孔板加入18μl，并同时加入不同浓度的药液(高1mg%、中0.1mg%和低0.01mg%)20μl/孔。以加入环磷酰胺及不加药作对照。CO2培养箱培养48h后，加入噻唑兰(MTT)PBS溶液5mg/ml，再培养4h,直接加入0.1ml二甲基亚砜振荡10min，于酶标仪570nm测A值。
1.6 茅莓总皂苷对HR8348直肠腺癌细胞细胞周期的影响
HR8348直肠腺癌细胞经茅莓总皂苷处理后用胰酶消化，PBS洗涤，70%乙醇固定，置于4℃冰箱内过夜。次日用PBS洗2次，调整细胞浓度至1×106/ml，用PI染液避光染色30min，流式细胞仪FACS Calibur检测。每样本检测10000个细胞，按FACSORT软件进行曲线拟合分析，计算DNA含量，得出细胞周期(G1、S、G2+M)的百分比。
1.7 统计学分析
各实验结果表示为(x±s),数据间差异性统计选用双侧t检验。
2 结果
2.1 MTT比色法测定茅莓总皂苷对HR8348结肠癌细胞增殖的影响
结果表明，高、中浓度茅莓总皂苷药对结肠癌细胞HR8348增殖有明显的抑制作用。见表1。表1 茅莓总皂苷对HR8348结肠癌细胞增殖的影响(略)注:与对照组5比较P<0.05
2.2 MTT比色法测定茅莓总皂苷对皮肤T细胞淋巴瘤细胞增殖的影响
结果表明，高、中浓度茅莓总皂苷药对皮肤T细胞淋巴瘤细胞Hut-78增殖有明显的抑制作用。见表2。表2 茅莓总皂苷对皮肤T细胞淋巴瘤细胞增殖的影响(略)
注:与对照组5比较P<0.05
2.3 MTT比色法测定茅莓总皂苷对A375人恶性黑色素瘤细胞增殖的影响
结果表明，高、中浓度茅莓总皂苷对A375人恶性黑色素瘤细胞增殖有明显的抑制作用。见表3。表3 茅莓总皂苷对黑色素细胞瘤A375细胞增殖的影响(略)
注:与对照组5比较P<0.05
2.4 MTT比色法测定茅莓总皂苷对人表皮癌A431细胞增殖的影响
结果表明，高、中浓度茅莓总皂苷药对人表皮癌A431细胞增殖无明显的抑制作用。见表4。表4 茅莓总皂苷对人表皮癌A431细胞增殖的影响(略)注：与对照组5比较P<0.05
2.5 茅莓总皂苷对HR8348直肠腺癌细胞周期的影响
如表5所示：茅莓总皂苷高、中浓度(1mg%、0.1mg%)作用于HR8348直肠腺癌细胞72h后，S期细胞分别占(53.05±1.75)和(47.87±1.51)与对照组比较有显著性差异(P<0.01，P<0.001)，细胞明显地被阻滞在S期，而且这种S期的阻滞呈剂量依赖关系。表5 茅莓总皂苷对HR8348直肠腺癌细胞周期的影响(略)注:与对照组比较#P<0.05,P<0.01,△P<0.001
3 讨论
近年来的研究表明植物中的三萜皂苷具有较强的抗肿瘤作用[1～3]，多数已作为抗癌中药试用于临床[4]。茅莓作为悬钩子属植物仅在民间作为抗肿瘤中草药应用，尤其是消化道肿瘤。近几年的研究发现茅莓提取物中含有多种三萜类化合物[5，6]，而国内至今未见有关抗肿瘤作用的实验研究。
本研究结果表明，通过MTT比色法检测茅莓总皂苷的体外抗肿瘤作用，其高、中浓度组对HR8348直肠腺癌细胞、A375黑色素细胞瘤细胞和Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤三种细胞有明显抑制作用。与对照组相比有显著性差异(P<0.05);为了研究茅莓总皂苷抗肿瘤作用机制，作者应用了流式细胞技术，分析了茅莓总皂苷对HR8348直肠癌细胞周期的影响。结果显示将细胞均阻滞在S期，使细胞不能进入M期进行有丝分裂，从而抑制直肠腺癌细胞的生长。
基金项目：杭州市科技局基金资助项目(2004433Q21) 杭州市卫生局基金资助项目(2004A006)
【参考文献】
1 Fujioka T，Kashiwada Y，Okabe H，et al.Antitumor agents 171.Cytotoxicities of lobatosides B，C，Dand E cyclic bisdesmosides isolated from Actinostemma lobatum Maxim.Bioorg Med Chem Lett，1996，6(23)：2807～2810.
2 Barthomeuf C，Debiton E，Mshvildadze V，et a1.In vitro activity of Hederacolchisid At compared with other saponins from Hedera colchica against proliferation of human carcinoma and melanoma cells.Plnta Med，2002，68(8)：672～675.
3 廖循，李伯刚，高小平，等.西南银莲花的活性三萜皂苷.中草药，2001，32(6)：493～496.
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