靶向bcl2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

　　作者：沈方臻，林明刚，肖文静，王宁宁 沈方臻(1962)，女，硕士，副主任医师，硕士生导师。 作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤中心，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 构建针对bcl2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体，转染到bcl2基因高表达的胃癌细胞株SGC7901中，并筛选出稳定低表达bcl2基因的细胞株。方法 针对bcl2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列，插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中，经脂质体介导转染SGC7901细胞。RTPCR检测bcl2基因在mRNA水平的变化, MTT 法检测bcl2基因沉默后胃癌SGC7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果 与对照组相比，转染成功后的细胞bcl2基因在mRNA水平均显著下降， 细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl2基因的SGC7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。

　　【关键词】 基因,bcl2;RNA干扰;质粒

　　STABLE CELL STRAINS EXPRESSING LOWER bcl2 GENE WERE ESTABLISED VIA bcl2 TARGETING SHORT HAIRPIN RNA PLASMID VECTOR

　　SHEN FANGZHEN, LIN MINGGANG, XIAO WENJING, et al

　　Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To construct a short, bcl2 genetargeting hairpin RNA (shRNA) plasmid vector, which was transfected to highbcl2geneexpressed gastric cancer line SGC7901, a cell strain with stable and low bcl2 gene expression was then screened. Methods Four pairs of oligonucleotide specific for bcl2 gene were designed, synthesized, and inserted intopGPH1/GFP/Neo plasmids. The vectors were transfected into SGC7901 cells with lipofectamine. RTPCR was used to detect bcl2 gene expression and MTT technique employed to detect the proliferation of tumor cells after bcl2 gene was silenced. Cells with the strongest inhibition were selected with G418 and the stable cell clones obtained. Results As compared with the control, themRNA expression of bcl2 in the transfected cells was significantly suppressed, the rate of cell proliferation was significantly reduced(t=2.41,P<0.05). Conclusion SGC7901 cell strains, which express stable and lower level of bcl2 mRNA, were successfully obtained by using bcl2targeting shRNA plasmid vector. The present study provided basis for research on gene therapy of gastric cancer.

　　[KEY WORDS] genes, bcl2; RNA interference; plasmids

　　bcl2基因具有多种生物学功能，不仅参与抑制细胞凋亡，同时又是一个独立的耐药基因[12]。阻断或下调bcl2基因的表达可以促进肿瘤细胞凋亡，增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，从而达到提高肿瘤治疗效果的目的[3]。RNA干扰(RNAi)技术是近年来新兴的特异性基因阻断技术，能高效特异地封闭内源性基因的表达，使细胞表现出特定基因表型的缺失[45]。本研究构建针对人bcl2短发卡RNA(shRNA)表达重组体，通过脂质体介导的转染方法将重组质粒转入人胃癌SGC7901细胞，观察并检测转染后细胞bcl2 mRNA表达，筛选出能够稳定表达shRNA的细胞株，为进一步研究bcl2 shRNA对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及研究bcl2基因功能奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及试剂

　　胃癌细胞株SGC7901购自中国科学院上海细胞生物研究所; 脂质体 Lipofectamine 2000、细胞总RNA提取试剂购自Invitrogene公司;RTPCR试剂盒购自宝生公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司;上下游引物由上海生物工程有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 靶向bcl2基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGPH1/GFP/Neo的特点，使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列EST同源的序列，选择4条片段作为bcl2基因干扰片段并设计1条乱序非编码片段作为阴性对照，分别为：位于35～55 bp的GGGAGATAGTGATGAAGTACA，位于354～372 bp的GCTGCACCTGACGCCCTTC，位于435～455 bp的GAGGATTGTGGCCTTCTTTGA，位于527～550 bp的GGATGACTGAGTACCTGAACCGGC，阴性对照为GTTCTCCGAACGTGTCACGT,设计完成后送上海生物工程有限公司合成,得到重组质粒分别命名为pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA1、pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA2、pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA3、pGPH 1/GFP/Neobcl 2 shRNA4以及pGPH1/GFP/NeoshNC，经上海英骏生物技术有限公司进行测序,显示载体构建正确。

　　1.2.2 细胞培养及转染

　　胃癌SGC7901细胞株置于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2细胞培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验，以2.5 g/L的胰酶消化传代。按照Lipofectamine 2000说明书进行转染。实验分为阳性干扰组:转染特异性质粒pGPH1/GFP/Neobcl 2 shRNA1～4;阴性对照组:转染非特异性质粒pGPH1/GFP/NeoshNC;空白对照组:未转染质粒。

　　1.2.3 RTPCR检测bcl2 mRNA的表达

　　收集以上各组细胞，提取总RNA。取RNA 5 μL，合成cDNA，再PCR扩增。bcl2引物序列：P1(上游)5′GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG3′, P2(下游)5′GGTGCCGGTTCAGGTACTCA3′, 扩增产物长为116 bp;同时选取GAPDH 作为内参照,GADPH 引物序列：P1(上游)5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′,P2(下游)5′TGAAGTCAGAGGAGACCACC3′, 扩增片段长度为407 bp。PCR反应参数：94 ℃变性4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33个循环; 72 ℃延伸7 min。于15 g/L的TAE琼脂糖凝胶上电泳检测，目的条带采用凝胶成像分析系统分析，测定各条带的灰度值，以bcl2与GAPDH 条带灰度值的比值作为bcl2 mRNA 的相对表达水平。bcl2 mRNA表达的抑制率=(1-实验组bcl2 mRNA 相对表达水平)/空白对照组bcl2 mRNA相对表达水平×100%。

　　1.2.4 MTT法检测bcl2基因沉默后胃癌SGC7901细胞的增殖

　　转染前1 d用2.5 g/L胰蛋白酶消化SGC7901细胞并计数，以每孔1×104个细胞接种于96 孔培养板，细胞融合达90% 以上时进行转染。每组设5个复孔，分别于转染24、48、72 h 后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，培养箱孵育4 h后离心弃上清，每孔加入0.05 mL的二甲基亚砜(DMSO)，待孔底紫色结晶物完全溶解后在瑞士TECAN公司多功能酶联检测仪上于波长570 nm处测定吸光度,实验结果取每组5个复孔的平均值，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验孔吸光度值)∕对照孔吸光度值×100%，并绘制细胞生长曲线。

　　1.2.5 统计学处理

　　采用SPSS 14.0及PPMS1.5[6]软件包进行统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 shRNA 表达质粒转染胃癌SGC7901细胞的观察

　　转染48 h后,在荧光显微镜下观察细胞,阴性对照组(shRNAN)和实验组(shRNA)的转染效率均达到(75.6±3.3)%，表明干扰质粒载体已被转染进入细胞并得到高效表达(图1)。

　　2.2 shRNA 转染后SGC7901 细胞bcl2 mRNA 的表达水平

　　转染48 h后分离各组细胞的总RNA 进行RTPCR。结果显示，与GAPDH组相比，shRNA各组的bcl2 mRNA表达均有不同程度下降，其中以shRNA2组下降最为明显，达80.7%，与空白对照组比较差异有显著性(t=2.35,P<0.05)。见图2。

　　2.3 bcl2基因沉默对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响

　　MTT检测结果显示，与阴性对照组相比，转染后各实验组SGC7901细胞增殖均受抑制，48 h 时细胞增殖抑制率达高峰，其中shRNA2组的抑制率最高(t=2.41,P<0.01)。相反，shNC组作用后SGC7901细胞抑制率与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

　　2.4 细胞转染与筛选

　　选择成功瞬时转染shRNA2质粒的SGC7901细胞，分别经400、800 mg/L 的G418培养液递增筛选,15 d后未转染细胞全部死亡，维持筛选3周后形成阳性克隆(图4),扩增培养备用，最终筛选维持浓度为400 mg/L。

　　3 讨 论

　　胃癌是全球第二大肿瘤，在我国胃癌则高居恶性肿瘤之首。虽然近十几年来胃癌的诊断和治疗手段有了很大的进步，但总体上早期诊断率低，疗效不佳，生存获益有限。胃癌整体治疗水平的提高有待于在更广泛、更深入的领域进行探讨。

　　随着分子生物学、分子遗传学的飞速发展以及基因工程技术水平的提高，基因治疗目前已成为肿瘤治疗的一大热点。bcl2基因是原癌基因中一种重要的抗凋亡基因，可在细胞周期的任一阶段抑制细胞凋亡。bcl2基因又是一个独立的耐药基因，其编码蛋白具有抗氧化作用，能阻断γ射线和化疗药物所导致的细胞凋亡[7],通过阻断或下调bcl2基因的表达可以促进肿瘤细胞凋亡，改善肿瘤细胞放化疗敏感性，从而达到肿瘤治疗的目的。

　　WACHECK 等[8]在SCID小鼠的胃癌模型中用bcl2反义寡核苷酸进行治疗，结果发现治疗组胃癌细胞bcl2表达降低，细胞凋亡增强，肿瘤体积变小，小鼠生存率上升。KIM等[9]用bcl2反义寡核苷酸治疗胃癌，结果显示胃癌细胞bcl2表达减少了60%，胃癌细胞对抗癌药物的敏感性增强且凋亡率上升，胃癌细胞的增殖受到抑制。故bcl2基因作为肿瘤基因治疗的重要研究靶点具有非常大的意义，我们有待探索一种更为有效、特异和更为稳定的基因封闭方法。RNAi是近年发展起来的沉默基因的新技术,与反义核苷酸技术相比较，RNAi特异性更高，作用更迅速，副作用小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统却没有影响[10]。RNAi具有较高的理论价值和广泛的应用前景，正在成为稳定而高效地沉默肿瘤细胞中原癌基因和防治肿瘤的一种新的有效方法[11]。

　　胃癌SGC7901细胞株系bcl2基因高表达株,本实验构建4个bcl2 shRNA表达重组体，分别为shRNA1、shRNA2、 shRNA3、shRNA4，并将其成功转染到胃癌SGC7901细胞株中,观察到各实验组bcl2 mRNA的表达均下调,胃癌细胞增殖明显受到抑制,其中shRNA2为4条序列中靶向抑制作用最强的序列。在此基础上本实验又成功筛选出稳定高表达shRNA的阳性克隆。 shRNA瞬时转染虽然具有良好的靶基因的沉默作用，但由于表达载体的排斥，随时间延长未转染shRNA的细胞增多，以及shRNA的降解，导致基因抑制时间缩短，抑制率逐渐下降，对实验结果产生影响。稳定转染细胞株在抗生素的维持下，较长时间内可以持续稳定地抑制目的基因的表达，且影响因素明显少于瞬时转染，其长效性和稳定性对肿瘤基因治疗具有较高的应用价值。为进一步研究该基因在胃癌发生发展中的作用，探索基因封闭对肿瘤放化疗敏感性的影响，提高胃癌治疗水平奠定了基础。

　　【参考文献】

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　　[10]HOLEN T, AMARZGUIOUI M, WIIGER MT, et al. Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger tissue factor [J]. Nuclei Acids Res, 2002,30(8):17571766.

　　[11]YIN J Q, GAO G S, SHAO R G, et al. siRNA agents inhibit oncogene expression and attenuate human tumor cell growth[J]. Exp Ther Oncol, 2003,3(4):194204.