胃癌患者胃粘膜EB病毒检测及意义
发表时间：2010-05-18 浏览次数：448次
作者：徐晓凤 朱炳良 朱亚平 作者单位：214500 江苏省靖江市人民医院
关键字：胃癌患者胃粘膜EB病毒检测及意义
EB病毒(Epstein-Barr Virus)为含包膜的双链DNA病毒，属人类疱疹病毒4型，已经证实EB病毒与低分化鼻咽癌及多种淋巴瘤密切相关。近年来通过检测胃癌组织细胞中EBV基因组发现EBV感染与胃癌的发生有关[1];然而，目前的研究尚不足以明确这种关系。作者于2005年对泰州地区162例胃粘膜标本进行EB病毒检测，以探讨本地区EBV感染与胃癌的相关性。
1 材料与方法
1.1 标本及来源
病例来源于医院胃镜检查者162例，男108例，女54例，平均年龄47.4岁。其中对照组94例，慢性浅表性胃炎64例、胃溃疡16例、慢性萎缩性胃炎14例;胃癌组68例，其中贲门胃体癌42例、胃角癌14例、胃窦癌12例;胃癌诊断均有病理学证实。不能及时检测标本置-20℃冷冻保存。
1.2 引物合成
参考文献[2]报道的序列设计引物，由上海××公司合成。引物Ⅰ5’—GTACTCATCACCGGGTCTC—3',引物Ⅱ5'—TTCGGGTTGGAACCTCCTTG—3'，扩增的产物长度为269bp。
1.3 试剂和仪器
Tag DNA多聚酶，4种脱氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，蛋白酶K，DNA提取液，TAE缓冲液，琼脂糖，溴化乙锭，液体石蜡等;美国ABI-7000荧光分析仪。
1.4 核酸提取
取米粒大小的胃镜钳取活检组织1～2块，在1.5ml Eppendorf管中用足量生理盐水漂洗3次，加300μl裂解液(10mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，1%SDS，300μg/ml蛋白酶K)，用研磨器研磨成匀浆，55℃孵育1h，按常规的酶/氯仿方法抽提蛋白[3]，乙醇沉淀核酸，漂洗晾干，50μl TE缓冲液(pH8.0)溶解，取5μl作模板。EBV阳性对照由××公司提供。
1.5 PCR扩增
50μl反应体系中，含1×PCR Buffer(pH8.3 50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，0.09%明胶)1.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L 4×dNTPS，1U Taq DNA聚合酶，上下游引物各为0.5μmol/L，PCR模板5μl，上覆25μl液体石蜡，扩增程序为94℃预变性5 min，然后94℃ 30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃再延伸5 min。
1.6 产物分析
取PCR产物15μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶用溴乙锭染色，在80v电压下电泳20min后在紫外灯下观察结果，与阳性对照处于同一位置的为阳性，否则为阴性，阴性对照无扩增带。PCR分子量标记选择Puc19—DNA/MSPI Marker23，EB阳性应在269bp处。
2 结果
162例EBV DNA检出率，见表1。表1 162例胃粘膜标本EBV检测结果(略)
对照组EBV感染率为1.1%(1/94)，胃癌组EBV感染率为8.8%(6/68)。胃癌组与对照组用χ2检验，P<0.05，差异有显著性;慢性萎缩性胃炎EBV感染率为7.1%(1/14)，胃癌组EBV感染率为8.3%(6/68)，P>0.05，差异无显著性意义。
3 讨论
3.1 EB病毒是一类可引起世界人口普遍感染的病原微生物，其与胃癌发生的关系在近年来已成为研究热点。Shibata1991年首次运用原位杂交技术和PCR技术在淋巴细胞浸润的低分化胃癌中检测到EBV，随后又在1992年证实美国16%典型胃腺癌有EB病毒的存在，同时，日本的Tokunaga等用同样的方法证实在日本人中的6.9%的胃癌与EB病毒相关。国内有武汉报道胃癌组织中EBV检出率为15.4%[4]，本资料胃癌组EBV检测阳性率为8.8%，与对照组的1.1%，差异有显著性(P<0.05)。胃癌的EBV阳性率比其它地区略低，可能与所用引物不同或各地区感染率不一致有关。但能初步说明泰州地区EB病毒与胃癌的发生有相关性。
3.2 对EBV感染的研究多采用原位杂交法，该法技术要求高，敏感度低。作者采用PCR法检测EBV,并在本实验中采用了阳性对照和Marker PCR分子量标记，双重对照，保证了结果的准确、可靠，操作简便、实用，适用于临床标本。
3.3 EB病毒的致癌机制尚未完全阐明。现在认为，EB病毒首先出现在非肿瘤细胞内，携带EB病毒的胃上皮细胞可能逃避免疫监视，在长期的潜伏过程中，EB病毒可能抑制宿主细胞的防御功能，逐渐造成细胞转化，最后导致肿瘤发生。研究EB病毒与胃癌的关系有重要的临床意义，在早期胃癌中，如果EB病毒阳性，则无淋巴结转移，可以避免传统的根治术，但对于中晚期的胃癌，却无明显的区别，因此EBV检测对于临床治疗手段的选择具有指导价值。
3.4 EB病毒对胃癌发生的作用，还存在很大的分歧。本实验慢性萎缩性胃炎患者 EBV感染率为7.1%，这与胃癌组织EBV阳性率8.8%差异无显著性(P>0.05)，可能与样本量少有关，因此，还有必要对该地区两者的相关性进行大样本的进一步观察研究。
【参考文献】
1 Wu MS, Shun CT, Wu CC, et al. Epstein Barr virus associated gastric carcinomas: relation to H. pylori infection and genetic alterations J. Gastroenterology, 2000 , 118(6) : 1031～1038.
2 赵军理.胃粘膜损伤中EB病毒感染与P53抑癌基因突变的研究. 中国病毒学杂志,1999,14(4):296～302.
3 美. F·M 奥斯伯. 精编分子生物学实验指南. 北京：科学出版社,1998.31.
4 龙焱华. 91例胃粘膜EB病毒感染的检测. 中华消化内科杂志,1998，15(3):182～183.
