氯化甲基汞抗裸鼠皮下U251胶质瘤细胞的体内实验研究

　　作者：柳影 陈 儇 毕晓颖 李志超 袁长吉 作者单位：(吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 在建立裸鼠皮下U251胶质瘤模型基础上，通过体内实验及相关形态学研究，分析氯化甲基汞(MMC)的抗脑胶质瘤作用。方法 制备裸鼠皮下U251胶质瘤模型，随机分为对照组和实验组，实验组裸鼠注射U251脑胶质瘤细胞1 w后，每天灌胃给予10 mg/kg体重MMC，连续5 d，对照组给予相同体积的生理盐水。全部裸鼠于肿瘤接种后14 d处死。结果 大体病理显示实验组肿瘤体积明显小于对照组，病理组织学观察发现实验组U251胶质瘤细胞生长密度较对照组低，并可见细胞体积变小、核固缩等凋亡的形态学改变。透射电镜显示实验组肿瘤细胞发生核固缩、染色质周边化、核断裂、胞浆空泡变性等改变，实验组瘤体汞含量明显高于对照组。结论 MMC对裸鼠U251胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用，其机制可能是通过诱导胶质瘤细胞凋亡实现的，相关分子机制有待进一步深入研究。

　　【关键词】 氯化甲基汞;胶质瘤;细胞增殖;细胞凋亡

　　The morphology study in apoptosis effect of methylmercuric chloride on brain neuroglioma

　　LIU Ying， CHEN Xuan， BI XiaoYing, et al.

　　The First Hospital of Jilin University, Changchun 130012, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To study the morphology change in apoptosis effect of methylmercuric chloride (MMC) on brain neuroglioma. Methods Experimental group were lavaged with MMC for 5 d and 10 mg/kg BW per day after the conduction of the athymic rat model of neuroglioma, control group was given with sodium chloride at the same dose. Results Oncopathology study showed that the average tumor volume of experimental group was smaller than those in control group obviously, the experimental group showed a lower density and a smaller volume than those in control group from HE stain. The phenomenon of karyopycnosis, liquefaction and anachromasis also could be seen in some cells. The neuroglioma cells were represented pyknosis, chromoplasm margination, nuclear fragmentation and vacuolar degeneration by perspective electron microscope. Conclusions MMC is capable of inhibiting the proliferation of rat C6 neuroglioma cells in vivo. The possible mechanism is that MMC is capable of deducing apoptosis in neuroglioma cells. The molecule mechanism of inhibitory effect of MMC on brain neuroglioma are requested for research to advance.

　　【Key words】 Brain neuroglioma; Methylmercuric chloride; Apoptosis; Morphology

　　目前胶质瘤的治疗仍是以手术为主的综合治疗,但即使接受积极的手术治疗及放、化疗,患者也通常在诊断后1年内死亡，所以目前胶质瘤的二线治疗仍围绕寻找易于透过血脑屏障的有效化疗药物。近些年来，本课题组在探讨氯化甲基汞(MMC)神经毒性作用机制的基础上，根据其结构理化性质、药物动力学特点和多靶点的抗肿瘤特性，提出了用MMC治疗脑胶质瘤的新思路，并通过体外实验初步证实了其对脑胶质瘤的抗肿瘤活性〔1〕。本文拟通过体内实验探讨MMC对裸鼠皮下U251胶质瘤细胞的抗肿瘤活性。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 MMC(Merck公司)，IMDM细胞培养基、FBS胎牛血清(Gibco公司)。

　　1.2 动物 裸鼠20只，雌雄各半，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在清洁级条件下进行实验。

　　1.3 U251胶质瘤细胞培养 U251胶质瘤细胞由吉林大学白求恩医学院病理学教研室惠赠，本室保存。U251胶质瘤细胞在含有10%胎牛血清的IMDM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。每天更换1次培养液，在细胞处于对数生长期大约长满80%时，用0.25%胰酶(PBS配制)消化贴壁细胞，收集离心，Hank’s液洗涤3次，制成单细胞悬液，冰浴条件下存放待用。

　　1.4 裸鼠U251胶质瘤动物模型的建立 上述细胞悬液调至细胞浓度为3×105/ml，细胞活力用台盼蓝检测，细胞存活率>90%，用微量注射器吸取上述悬液，每只裸鼠右后肢外侧皮下注射100 μl单细胞悬液。

　　1.5 分组及实验方法 上述动物模型随机分为对照组和实验组，实验组裸鼠注射U251胶质瘤细胞1 w后，每天灌胃给予10 mg/kg体重MMC，连续5 d，对照组给予相同体积生理盐水。

　　1.6 肿瘤病理组织学检查 两组裸鼠于肿瘤接种后14 d处死，取瘤体组织，测量瘤体大小(肿瘤大小=肿瘤长径×短径2×0.5)，部分瘤体置于4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡浸透包埋。采用HE染色法制备肿瘤病理组织学标本，肿瘤组织切片厚度为5 μm，石蜡切片常规二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水。苏木精染色10 min，1%盐酸酒精浸数秒，弱碱性水溶液显蓝。水溶性伊红染色。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察肿瘤病理组织学改变。采用常规电镜标本制备方法，用LKBⅢ型超薄切片机制备肿瘤电镜观察标本，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，EM1200EX型透射电子显微镜(日本)观察两组肿瘤的超微结构改变。

　　1.7 肿瘤内汞含量测定 采用Varian Spector AA220原子吸收分光光度计，用氢化物原子吸收法测定。

　　1.8 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 肿瘤大体病理 裸鼠接种U251胶质瘤细胞14 d后，实验组皮下肿瘤体积〔(12.69±6.19)mm3〕明显小于对照组〔(160.87±61.64)mm3〕(P<0.05)。

　　图1 肿瘤组织HE染色

　　图2 肿瘤组织透射电镜超微结构观察2.2 肿瘤组织病理学检查结果 HE染色镜下可见对照组U251胶质瘤细胞丰富密集，坏死少;实验组U251胶质瘤细胞生长密度较对照组降低，细胞数目较对照组减少，并可见细胞体积变小、核固缩、深染等凋亡细胞的形态学改变，部分区域出现液化坏死。见图1。透射电镜观察实验组肿瘤细胞发生固缩，染色质周边化，核断裂，胞浆可见空泡变性等改变。见图2。

　　2.3 肿瘤内汞含量测定 对照组肿瘤内汞含量〔(0.003 0±0.002 0)μg/g〕明显低于实验组〔(2.269 2±0.128 9)μg/g〕(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　目前胶质瘤的治疗仍是以手术为主的综合治疗,但由于缺少早期诊断方法,确诊时大部分脑肿瘤因发生广泛浸润而无法切除;微小的浸润性病灶无法用影像学方法定位,因此难以进行精确放疗;多数抗癌药无法穿透血脑屏障,而能够穿透血脑屏障的药物又对脑肿瘤疗效较差，所以即使接受积极的手术治疗及放、化疗,患者平均存活期不超过12个月〔2〕。

　　近年来新的治疗方式包括基因治疗、光动力治疗等对胶质瘤疗效仍有争议〔3，4〕,化疗药物由于血脑屏障及肿瘤异质性和内在耐药性的存在,一直疗效较低,即使目前使用的新药替莫唑胺(TMZ),联合放疗仅可使胶质瘤患者的中位生存期达到14.6个月〔5〕,而将近67.2%～76.0%的胶质瘤患者对常用的化疗药亚硝脲类及新药TMZ产生耐药。因此,寻找有效的靶向治疗药物是当今胶质瘤研究的热点。

　　MMC属于烷基汞化合物，结构式为CH3HgCl，分子量小、碳链短、碳汞共价结合牢固、不易分离、具有良好的脂溶性，极易透过血脑屏障。Berlin等〔6〕给鼠猴喂饲含有放射性标记甲基汞的乳汁，研究MMC的药代动力学，结果表明甲基汞在脑中靶蓄积，脑与血汞的比值为5.6,说明脑是MMC蓄积的靶器官。

　　MMC具有引起DNA断裂、抑制微管解聚、阻止细胞有丝分裂、诱导细胞凋亡、干扰细胞周期进程等多靶点作用;本课题组已通过体外实验证实了MMC对C6胶质瘤细胞、白血病细胞的增殖具有明显抑制作用〔1，7〕，本文通过体内实验探讨MMC对裸鼠皮下U251胶质瘤细胞的抗肿瘤活性，结果显示实验组肿瘤体积小于对照组，组织病理学观察见实验组肿瘤细胞密度降低，细胞数目减少，体积变小，部分细胞固缩变成圆形，呈散在分布，并可见细胞收缩体积变小，核固缩蓝色深染，部分区域出现液化坏死。透射电镜病理可见实验组肿瘤细胞发生固缩，染色质周变化，核断裂，空泡变性，线粒体肿胀，其内可见空泡等改变，这些结果显示了与细胞凋亡相一致的超微结构变化。

　　综上可见，MMC具有抑制裸鼠皮下U251胶质瘤细胞增殖的作用，其机制可能是通过诱导胶质瘤细胞凋亡实现的，下一步将探讨MMC诱导脑胶质瘤细胞凋亡与其相关因子的改变，以揭示其抗肿瘤作用的分子机制，为开发自主知识产权新药提供实验基础。

　　【参考文献】

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