肺癌肿瘤抑制物1转染HepG2肝癌细胞及对细胞周期、细胞凋亡及caspase3的影响

　　作者：肖钟迪 王雅丽 房学东 作者单位：(吉林大学第二医院，吉林 长春 130041)

　　【摘要】 目的 将已构建完成的携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体转染到HepG2细胞中，观察其对HepG2肝癌细胞的作用。方法 脂质体Lipofectamine 2000介导重组载体转染到HepG2肝癌细胞中，经G418筛选建立稳定转染细胞株，分别采用RTPCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达;同时检测细胞周期、凋亡及caspase3酶活性。结果 与对照组比较，RTPCR方法可见转染组细胞TSLC1 mRNA表达明显增多(P<0.05)，免疫组化和Western印迹法可见转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高(P<0.05);流式细胞仪检测发现转染组G0/G1期细胞显著增多，而S期细胞明显降低(P<0.05)，转染组细胞凋亡比例明显比对照组多(P<0.05);caspase3酶活性显著增多(P﹤0.05)。结论 本实验成功建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株，并证实TSLC1能够阻滞细胞周期，促进凋亡及提高caspase3酶活性。

　　【关键词】 TSLC1;转染;克隆;HepG2;细胞周期

　　肺癌肿瘤抑制物1(tumor suppressor of nonsmall cell lung cancer 1，TSLC1)是一种新的肿瘤抑制基因，最早由Gomyo等〔1〕于1999年分析人类染色体11q23.2区域所发现。2001年Kuramochi等〔2〕研究人类肺癌时，通过功能性互补的方法证明TSLC1具有肿瘤抑制能力。目前，国内外对于真核表达载体pReceiverM29连接TSLC1基因转染肝癌HepG2细胞并研究其抑制肝癌机制的报道较少。本实验将已构建完成的真核表达载体pReceiverM29TSLC1转染到HepG2肝癌细胞中，建立稳定转染TSLC1的HepG2肝癌细胞株，探讨TSLC1对肝癌细胞的抑制机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 质粒小提试剂盒、Marker DL2000、dNTP、PCR反应试剂盒、RNA提取试剂盒、DMEM、小牛血清、二抗羊抗兔IgG购自天根生化科技有限公司;TaqDNA 聚合酶购于大连宝生物工程有限公司;逆转录cDNA合成试剂盒购自Fermentas Life sciences公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;抗人TSLC1单克隆抗体为Santa Cruz公司;Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;caspase3试剂盒购自碧云天生物技术研究所;G418购自宝泰克生物工程公司;PI购自Sigma公司;其他相关试剂由本人采购。

　　1.2 稳定转染HepG2细胞珠的建立 细胞转染按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行。实验分为2组：将稳定转染TSLC1的细胞株命名为pReceiverM29TSLC1HepG2(转染组);将稳定转染空载体的细胞株命名为pReceiverM29HepG2(对照组)。最后，经过G418(400 μg/ml)连续加入，每3 d换1次液体，直至产生单克隆，挑取单克隆培养，最终建立稳定转染TSLC1和对照质粒的HepG2细胞株。

　　1.3 RTPCR检测稳定转染细胞株中TSLC1 mRNA的表达 分别提取转染组和对照组细胞的总RNA，以OligoT为引物进行逆转录，然后进行PCR克隆，以5′GGAATTCATGGCGAGTGTAG3′为上游引物，以5′CGGTACCCTAGATGAAGTA3′为下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。克隆产物经琼脂糖凝胶电泳，最后分析灰度值，每组各重复3次。

　　1.4 免疫组化方法检测稳定转染细胞株中TSLC1蛋白的表达 消毒处理过的盖玻片种植在24孔板内，每个盖玻片上分别接种约1×106个转染组和对照组细胞，孵箱37℃、5% CO2孵育24 h;第2天弃去培养液，加入4%多聚甲醛固定30 min;然后0.3% Triton100 10 min，3% H2O2孵育5 min，TSLC1单克隆抗体过夜，羊抗兔IgG抗体HRP 20 min后，DAB显色、复染、脱水、封片、最后镜下观察，采集图像并分析，计算阳性细胞率，每组重复3次。

　　1.5 Western印迹方法检测稳定转染细胞株中TSLC1蛋白的表达 将已制备好的转染组和对照组细胞经过细胞裂解液裂解，沸水变性10 min，超声粉碎30 s，13 000 r/min室温离心10 min，留上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度;蛋白质在经过连续SDSPAGE电泳分离后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭60 min，与一抗TSLC1单克隆抗体过夜;与二抗孵育2 h，DAB显色，最后采集结果，分析数据。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 两组细胞培养3 d后，分别取约1×106个细胞，PBS洗2次，加入3倍体积70%冰乙醇过夜，50 μg/ml碘化丙啶250 μl，PBS 240 μl，RNase 10 μl，避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。

　　1.7 caspase3的检测 按照碧云天生物技术研究所caspase3试剂盒说明书进行。

　　1.8 统计学方法 所有数据均应用SPSS10.0统计学软件进行检验，两组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 pReceiverM29TSLC1转染HepG2肝癌细胞 利用G418连续筛选，产生单克隆，最后建立稳定转染的细胞株，由于pReceiverM29带有绿色荧光蛋白，在显微镜下能够观察到绿色荧光克隆。见图1。

　　2.2 RTPCR检测转染组TSLC1 mRNA的表达 RTPCR结果可见转染组TSLC1 mRNA的表达比对照组明显增多，经灰度分析组间比较具有统计学差异(P<0.05)。见图2。

　　2.3 免疫组化检测TSLC1蛋白的表达 转染组细胞TSLC1蛋白表达棕黄色细胞明显比对照组多。转染组细胞TSLC1中染色较多(图3A)，阳性细胞计数为(95.63±2.15)%，对照组TSLC1染色较少(图3B)，阳性细胞计数为(41.27±3.45)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　图3 免疫组化法检测细胞TSLC1蛋白表达(×400)

　　2.4 Western印迹法检测转染组TSLC1蛋白的表达 转染组细胞TSLCI蛋白(图4A)表达明显比对照组细胞(图4B)多，经过灰度分析，组间比较具有统计学差异(P<0.05)。

　　2.5 细胞周期及细胞凋亡的改变 转染组较对照组G1期细胞显著增多，而S期和G2/M期细胞明显降低(P<0.05)，同时转染组细胞凋亡比例明显比对照组高(P<0.05)。见表1。表1 转染组和对照组细胞的细胞周期及凋亡

　　2.6 caspase3的活性检测 转染组细胞caspase3酶活性〔(0.580±0.104)IU〕较对照组细胞caspase3酶活性〔(0.317±0.245)IU〕显著增多(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　TSLC1属于细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，TSLC1具有多种生物学作用：参与细胞间黏附、介导免疫监视，参与细胞运动及信号转导等作用。研究表明TSLC1基因与喉癌〔3〕、宫颈癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、鼻咽癌〔6〕以及消化系统多种恶性肿瘤有关，其在肿瘤的发生、发展中起负性作用。该基因的表达失活与肿瘤的浸润程度、转移和预后情况有关，而基因失活机制主要之一是发生TSLC1基因启动子的甲基化。Ito等〔7〕研究TSLC1基因在食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞株和人原发性食管癌中的mRNA表达中发现,75% ESCC细胞株和50%的原发性食管癌发生TSLC1表达缺失;进一步研究还发现，与TSLC1表达的癌组织相比，TSLC1表达低的食管癌浸润程度深,转移率也高。Kuramochi等〔2〕将人类11号染色体转入肺癌细胞株A549中发现，TSLC1在A549及其他人类非小细胞性肺癌中表达缺失或明显下降，且表达缺失与TSLC1启动子甲基化密切相关。近年来，Ando等〔8〕运用免疫组化方法研究发现TSLC1在恶性神经母细胞瘤中显著降低，108例恶性神经母细胞瘤患者中，降低表达的TSLC1基因与患者的不良预后显著相关。此外，该项研究还发现TSLC1能够降低人类神经母细胞瘤SHSY5Y细胞系的增殖活性。该研究认为TSLC1可以作为神经母细胞瘤的候选抑癌基因。

　　目前，Kuramochi等〔2〕研究了31例原发性肝癌标本和8株肝癌细胞系，发现TSLC1基因启动子发生甲基化率为29%，3株肝癌细胞系TSLC1表达缺失，这些均提示TSLC1与肝癌的发生相关。李文涛等〔9〕应用免疫组化和Western印迹方法检测TSLC1蛋白在50例原发性肝癌组织中的表达情况，发现TSLC1蛋白在原发性肝癌组织中的阳性率为34%,明显低于癌旁组织(72%)，该研究认为TSLC1蛋白可能在原发性肝癌中表达降低，TSLC1蛋白对肝癌的发生、发展可能起到抑制作用。为进一步探讨TSLC1是否具有抑制肝癌作用，本研究将已构建完成的真核表达载体pReceiverM29TSLC1转染到HepG2肝癌细胞中，并且最终建立了稳定转染TSLC1基因的HepG2肝癌细胞株;同时，本研究还发现，与对照组比较，流式细胞仪检测转染组G1期细胞显著增多，而S期和G2/M期细胞明显降低，凋亡细胞比例明显增高，caspase3酶活性显著增多。提示TSLC1可能通过阻滞细胞周期、促进细胞凋亡及升高caspase3的酶活性等发挥抗肿瘤的作用，这为进一步研究TSLC1抗肿瘤作用机制奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1 Gomyo H,Arai Y，Tanigami A,et al.A 2Mb sequence ready contig map and a novel immunoglobulin superfamily gene IGSF4 in the LOH region of chromosome 11q23.2〔J〕.Genomics,1999;62(2):139.

　　2 Kuramochi M，Fukuhara H，Nobukuni T,et al.TSLC1 is a tumorsuppressor gene in human nonsmallcell lung cancer〔J〕.Nature Genetics，2001;27 (4)：427-30.

　　3 王军利,张惠中,白万胜,等.喉癌组织中TSLC1基因启动子过甲基化及mRNA表达〔J〕.第四军医大学学报,2007;28(7):6513.

　　4 Yang YX，Yang AH，Yang ZJ,et al.Involvement of tumor suppressor in lung cancer gene expression in uterine cervix cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2006;16(5):186872.

　　5 Heller G，Geradts J，Ziegler B,et al.Down regulation of TSLC1and DAL1 expression occurs frequently in breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2007;103 (3):28391.

　　6 Lung HL，Cheng AK,Xie D,et al.TSLC1 is a tumor suppressor gene associated with metastasis in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer Res,2006;66(19):938592.

　　7 Ito T,Shimada Y，Hashimoto Y,et al.Involvement of TSLC1 in progression of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer Res,2003;63(19):63206.

　　8 Ando K，Ohira M，Ozaki T,et al.Expression of TSLC1，a candidate tumor suppressor gene mapped to chromosome 11q23，is down regulated in unfavorable neuroblastoma without promoter hypermethylation〔J〕.Int J Cancer，2008;123(9):208794.

　　9 李文涛，白华龙，周 闯,等.原发性肝癌中抑癌基因TSLC1蛋白的表达及其临床意义〔J〕.第四军医大学学报,2007;28(7):21413.