散发性大肠腺癌易感性与谷胱甘肽转硫酶P1基因型的关系

作者：蓝德云 蔡长江作者单位：325500 浙江省温州市泰顺县人民医院内科 【摘要】目的 探讨中国汉族人群散发性大肠癌(SCRAC)易感性与谷胱甘肽转硫酶(GST)P1基因型的关系。方法 采用聚合酶链反应技术(PCR)检测108例大肠癌患者和120例健康人群的GSTP1基因型，采用χ2检验，分析比较GSTP1基因型频率在SCRAC组和健康对照组之间的分布差异。 结果 GSTP1基因VaL/VaL基因型频率在SCRAC组中明显增高，与对照组相比，有显著性差异(43.5%vs30.8%,P=0.002,OR=0.430,95%CI:0.250～0.739)；根据临床特征对SCRAC组进行分层分析，发现VaL/VaL基因型与SCRAC病变部位无关(P>0.05)，但在Dukes C期和低分化SCRAC患者中分布频率均明显增高(P<0.05)。结论 GSTP1基因型与中国汉族人群SCRAC的易感性相关。 【关键词】  谷胱甘肽转硫酶P1 基因型 散发性大肠癌 易感性　　【Abstract】  Objective  To investigate the relationship between the genotype of glutathione S-transferase P1 and the susceptibility to sporadic colorectal adenocarcinoma(SCRAC) in Chinese Hans. Methods  Polymerase chain reaction(PCR) was used in the study of GSTP1 genotype, then the discrepancies of GSTP1 genotype frequencies were analysed between 108 SCRAC patients and 120 healthy controls by χ2 test. Results  The frequency of VaL/VaL genotype was higher in the SCRAC patients than that in the controls (43.5%vs30.8%,P=0.002,OR=0.430,95%CI:0.250～0.739).To stratificate the SCRAC patients by clinical features, we found there were no association between the frequency of VaL/VaL genotype and the location of SCRAC (P>0.05).However, the VaL/VaL  genotype of GSTP1 was significantly associated with colorectal adenocarcinoma of Dukes C classification (χ2=7.380,P=0.007,OR=0.347,95%CI:0.160～0.753 ) and poor differentiation (χ2=11.213,P=0.001,OR=0.270,95%CI:0.124～0.590 ), respectively. Conclusions  The GSTP1 genotype is strongly correlated with the susceptibility to sporadic colorectal adenocarcinoma in Chinese Hans.　　【Key words】  Glutathione S-transferase P1  Genotype  Sporadic colorectal adenocarcinoma  Susceptibility    　　　　谷胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferase ,GST) 在人体中广泛存在，尤其在生殖腺、肝脏及结肠中较高表达,属体内重要的Ⅱ相代谢酶。GST能催化Ⅰ相代谢过程所产生的多种致癌物质与谷胱甘肽(GSH)巯基(-SH)共轭结合，形成亲水性物质排出体外，从而影响机体对毒性物质的解毒作用。GSTP1属GST家族重要成员，该基因第303位点碱基发生A→G突变后，其105密码子异亮氨酸被缬氨酸取代，可引起GSTP1酶活性下降，机体对多种毒性物质降解能力下降，导致肺癌、膀胱癌等多种肿瘤危险性增加［１，２］。散发性大肠癌(SCRAC)发病机制主要涉及环境和遗传两方面，而环境因素致癌在很大程度上取决于个体发生肿瘤的易感性。毒物代谢酶的基因多态现象是肿瘤遗传易感性的重要方面。本研究通过检测比较GSTP1基因型频率在中国浙江汉族正常人群及SCRAC患者之间的分布差异，旨在阐明GSTP1基因型与SCRAC遗传易感的相关性。　　1  临床资料　　1.1  一般资料 　　选择2002年4月至2006年11月本院108例经病理组织学确诊的SCRAC患者,其中男74例，女34例；平均年龄（49.1±4.3）岁；癌肿位于近端结肠者(盲肠、升结肠及横结肠)43例，远端结肠者（降结肠、乙状结肠及直肠)65例；Dukes分期：A期24例、B期45例、C期39例；肿瘤组织分化程度：高分化28例、中分化39例、低分化41例。对照组共120例，系同期门诊健康体检者，其中男78例，女42例，年龄20～65岁，平均年龄(48.8±6.7)岁。全部研究对象均为无血缘关系的浙江汉族人，SCRAC患者采血前均未行放、化疗。

　1.2方法  　　(1)提取DNA：取外周静脉血5ml，EDTA抗凝，蛋白酶K消化，酚/氯仿法抽提DNA。(2)GSTP1基因型检测：采用PCR技术扩增GSTP1目的基因。引物由上海生物工程有限公司合成，引物1:5’GTAGTTTGCACAAGGTCAAG3’；引物2：5’ACAAACCTGAGGGGTAAG3’。PCR反应总体系25μl 中含10×PCR缓冲液5μl；2.5μl MgCl2（2.5mmol/L）， dNTPs（200μmol/L）1.5μl，引物（100pmol/L）各1μl，DNA聚合酶2.5U，模板DNA40ng，其余用灭菌双蒸水补足。反应条件，97℃预变性5 min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃再延伸7min。PCR反应产物用BsmAⅠ限制性内切酶消化，酶切产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳及1.8‰硝酸银染色检测。GSTP1基因型判断：若酶切产物含329bp、113bp2个片段，则为ILe/ILe基因型(野生型)；若酶切产物含329bp、216bp、113bp 3个片段，则为ILe/VaL基因型(杂合突变型);若酶切产物含216bp、113bp 2个片段，则为VaL/VaL基因型(纯合子突变型)。

　　1.3  统计学处理

　　采用χ2检验分析数据，计算OR值和95%可信区间，P<0.05有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  纯合子突变基因型(VaL/VaL)在SCRAC组中频率明显增高，有显著性差异(43.5%vs30.8%,P=0.002,OR=0.430,95%CI:0.250～0.739)。见表1。表1  GSTP1基因型在SCRAC组及健康对照组中的分布比较(略)

　　2.2  在SCRAC患者中，VaL/VaL基因型在远端组和近端组之间比较，无显著性差异(P>0.05)，表明GSTP1基因型与SCRAC病变部位无相关性；但在Dukes C期和低分化腺癌中，VaL/VaL基因型频率均明显增高,采用χ2检验，有显著性差异(P<0.05)。见表2。表2  GSTP1基因型与SCRAC亚型的关系(略)

　　GSTP1基因型多态性与中国汉族人群SCRAC明显相关，VaL/VaL基因型携带者发生SCRAC的易感性增加。

　　3  讨论

　　大肠腺癌发病机制与遗传和环境因素均有关系，据现代遗传学观点，大肠癌分为遗传性和非遗传性两大类，多数学者认为几乎所有大肠癌都存在基因变异因素(包括先天性、后天获得性)，而后者主要指环境因素诱发所致的正常基因突变，而环境因素致癌取决于个人对肿瘤的易感性。    　　　　谷胱甘肽转硫酶(GSTs)是人体内重要的毒物代谢酶超家族，包括4个主要成员：GSTsα(GSTA) 、GSTsμ(GSTM) 、GSTsП(GSTP) 、GSTsθ(GSTT),均具有遗传多态性。GSTs在人体内广泛存在，不仅对毒性代谢产物起解毒作用，而且在保护人体DNA避免损伤及促进DNA修复方面亦发挥重要作用。理论上，GSTs酶活性降低或缺失将增加人体正常细胞的突变，促进肿瘤形成。GSTs在体内解毒作用与其活性密切相关，而GSTs的活性是由GST基因的遗传多态性所决定，GST基因多态性使不同个体GSTs对体内多种毒性代谢产物及致癌物的清除能力产生差异，从而影响人体对多种疾病尤其是肿瘤的易感性［3］。如GSTM1基因突变后产生空白GSTM1基因型，携带这种基因型者，肝脏中不能表达相应的GSTM1蛋白，体内GSTM1酶活性减低甚至缺乏。GSTM1基因产物主要在致癌性环氧化物和多环芳香族碳氢化合物的解毒方面具有重要作用，因此携带空白GSTM1基因型的个体对多种肿瘤的易感性增加，GSTT1酶主要参与人体对烟草中所含毒物的代谢，如甲烷、氧化乙烯等。与空白GSTM1相似，空白GSTT1基因型携带者体内所有组织缺乏GSTT1酶，因此导致人体对某些疾病的易感性增加，但研究结果都不尽相同，可能与种族、样本大小、实验方法等因素的不同有关。

　　GSTP1酶不仅在体内发挥解毒、抗氧化等作用，还通过调节细胞激酶活性而影响细胞的增殖［4］。GSTP1酶的活性与其基因型密切相关，在其3种基因型中，纯合子突变型(VaL/VaL)携带者体内GSTP1酶活性最低，因此该基因型携带者对毒性物质清除能力也最低，对多种疾病的易感性增加。国外研究显示GSTP1基因在白种人群中的突变率约为50%(包括纯合子突变型和杂合子突变型)［5］。本研究发现在中国正常汉族人群中GSTP1基因突变率为68.5%(74/108)，高于外国人群。有关GSTP1基因与疾病相关性的研究显示，GSTP1突变基因型与隐源性肝硬化［6］、急性白血病［7］、子宫颈癌［8］、卵巢癌［9］等相关,并且能通过影响化疗药物在体内的代谢而与肿瘤患者的预后及存活率相关。本研究结果显示，GSTP1基因型中纯合子突变基因型(VaL/VaL)在SCRAC组中频率增高。根据临床特征在SCRAC组中进行分层分析，发现VaL/VaL基因型与SCRAC的发生部位无关(P>0.05)；但在Dukes C期和低分化腺癌中，VaL/VaL基因型频率均明显增高,有显著性差异(P<0.05)。提示GSTP1基因型与中国汉族人群SCRAC有相关性，纯合子突变基因型(VaL/VaL)携带者发生SCRAC的易感性增加。

　国内曾有学者探讨过N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因与SCRAC的关系［10］,发现慢性乙酰化基因型在SCRAC组中明显增高，而且慢性乙酰化基因型频率在远侧结肠癌、Dukes C期及低分化结肠癌病例中均明显增高，提示NAT2慢性乙酰化基因型与中国汉族人群结肠癌密切相关。谷胱甘肽转硫酶与N-乙酰基转移酶都属人体重要的毒物代谢酶，两类酶的活性分别受GST基因和NAT基因多态性的影响。本研究结果证实GSTP1纯合子突变基因型(VaL/VaL)与SCRAC相关，从理论上推测其原因可能是：携带VaL/VaL基因型的个体，由于其体内GSTP1酶活性降低，毒性代谢产物容易在体内蓄积，引起人体内环境紊乱，在其他诱发因素的共同参与下，通过激发肠黏膜组织细胞突变并影响DNA修复，最终导致SCRAC的发生。

【参考文献】  　　1 Tokumaru Y,Harden SV,Sun DI,et al.Optimal use of a panel of methylation markers with GSTP1hypermathylation in the diagnosis of prostate adenocarcinoma.Clin Cancer Res,2004,10:5518～5522.

　　2 Harden SV,Sanderson H,Goodman SN,et al.Quantitative GSTP1 methylation and detection of prostate adenocarcinoma in sextant biopsies.J Natl Cancer Inst,2003,95:1634～1637.

　　3 Joanne E, Curran, Stephen R, et al.Polymorphisms of glutathione transferase genes (GSTM1,GSTP1 and GSTT1) and breast cancer susceptibility.Cancer letters, 2000,153: 113～120.

　　4 Ruarmacologicscoe JE,Rosario LA,Wang T,et al.Pharmacologic or genetic manipulation of glutathione S-transferase P1～I(GSTP1i)influences cell proliferation pathways.J Pharmacol Exp Ther, 2001,298:339～345.

　　5 Watson MA,Stewart RK,Smith GB,et al.Human glutathione S-transferase P1 polymorphisms:relationship to lung tissue enzyme activity and population frequency distribution.Carcinogenesis, 1998,19(2):275～280.

　　6 Sbabrokb MG,Gbobadloo MS,Babram Y,et al.GSTP1,GSTM1,and GSTT1 genetic polymorphisms in patients with cryptogenic liver cirrhosis.Journal of Gastrointestinal Surgery,2004,4(8):423～427.

　　7 Zhang Ye,Honglin Song.Glutathion s-transferase polymorphisms(GSTM1,GSTP1 and GSTT1)and the risk of acute leukaemia:A systematic review and meta-analysis.European Journal of Cancer,2005,41:980～989.

　　8 Sobti RC,Satinder K,Pushpinder K,et al.Interaction of passive smoking with GST(GSTM1,GSTT1,and GSTP1)genotypes in the risk of cervical cancer in India.Cancer Genetics and Cytogenetics,2006,166:117～123.

　　9 Beeghly A,Katsaros D,Chen H,et al.Glutathione s-transferase polymorphisms and ovarian cancer treatment and survival.Gynecologic Oncology,2006,100:330～337.

　　10 蒋益，夏冰，薛战雄. N-乙酰转移酶2基因多态性与结肠腺癌易感性的关系.中华消化杂志,2007,1(27):15～18.