环氧合酶-2对非小细胞肺癌血管生成及预后的影响

　　作者：俞万钧 钟国平 修清玉 作者单位：315040 浙江省宁波市鄞州人民医院(俞万钧 钟国平)　200003 上海长征医院(修清玉)

　　【摘要】 目的 研究环氧合酶-2(COX-2)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其对血管生成和预后的影响。 方法 随访手术切除且临床资料完整的48例非小细胞肺癌患者，采用免疫组织化学技术检测活检标本中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)表达和微血管密度(MVD)。通过生存曲线法比较阳性组和阴性组患者的预后情况。 结果 COX-2在非小细胞肺癌组织中阳性表达率为66.7%(32/48)，与VEGF表达68.8%(33/48)呈显著正相关(r=0.687,P<0.01)，COX-2与淋巴结转移、组织分型、肺癌分期及较短生存期具有相关性。MVD随COX-2、VEGF表达增强而增高。 结论 COX-2的高表达可使VEGF表达上调，促进肿瘤血管形成，增加微血管密度。COX-2在非小细胞肺癌组织中高表达与肿瘤血管生成密切相关，可作为预测非小细胞肺癌预后的一种有用指标。

　　【关键词】 环氧合酶-2 非小细胞肺癌 血管生成 免疫组织化学 预后

　　【Abstract】Objective To assess the effect of cyclooxygenase-2(COX-2)expression on angiogenesis and prognosis in non-small-cell lung carcinoma(NSCLC).Methods SP immunohistochemistry was used to determine the expression of COX-2，vascular endothelial growth factor(VEGF) and microvessel density(MVD)of tumor tissue in 48 NSCLC patients. Kaplan-Meier and log-rank test were used to compare the survival time of COX-2 positive staining group with that of negative staining group.Results The COX-2 expression rate-66.7% (32/48)was positively related to VEGF expression(r=0.687, P<0.01)，with association with lymph node metastasis，histologic types, staging of lung cancer and shorter surviva1.Increase of MVD was in accordance with the up-expression of COX-2 and VEGF in tumor tissue. Conclusions COX-2 may up-regulate VEGF's expressions，promote angiogenesis and increase MVD in tumor,and can be used as a predictor of the prognosis of NSCLC.

　　【Key words】 Cyclooxygenase-2 non-small-cell lung carcinoma Angiogenesis Immunohistochemistry Prognosis

　　环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)参与某些恶性肿瘤的发生发展，其中一个重要途径可能与调节肿瘤血管生成有关，而新生血管是肿瘤生长、侵袭和转移的基础。作者采用免疫组织化学技术研究了48例非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)组织中COX-2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和微血管密度(microvascular density，MVD)，并结合临床资料，分析它们之间的相互关系及其与NSCLC侵袭、转移及预后的关系，旨在探讨COX-2对NSCLC血管生成及预后的影响, 以期为NSCLC的防治提供帮助。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选取2002年9月至2004年8月手术切除并经病理证实的NSCLC标本48例，术前均未接受化疗及放疗。其中男40例，女8例，年龄43～76岁(平均59.5岁);鳞癌25例，腺癌23例(腺鳞癌以其主要部分而计算在腺癌或鳞癌内);高分化(G1)12例，中分化(G2)16例，低分化(G3)20例;Ⅰ期9例，Ⅱ期18例，ⅢA期18例，ⅢB-Ⅳ期3例;镜检有淋巴结转移20例。生存11～45个月。

　　1.2 实验方法

　　免疫组织化学染色检测肺癌组织中COX -2、VEGF和CD34的表达。免疫组化EnVisionTM+System试剂盒。由Dako公司提供，PowerVisionTM试剂盒由中山生物公司提供;鼠抗人COX -2一抗、鼠抗人VEGF一抗、鼠抗人CD34一抗由Neo Markers公司提供。标本经4% 中性福尔马林固定，石蜡包埋切片。将切片贴于经10%多聚赖氨酸(Poly-L-Lysime)预处理的玻片上，染色采用两步法，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用已知的阳性切片同时同一条件下染色作为阳性对照，以PBS替代第一抗体作为阴性对照。

　　1.3 结果判定

　　在光镜下观察呈棕黄色为阳性反应。按阳性细胞数及阳性信号出现的位置判断结果， COX-2、VEGF免疫组化染色积分的分值评定标准：染色范围(阳性细胞比率)分0-4级，阴性为0，阳性细胞1%～25%为1，阳性细胞26%～50%为2，阳性细胞51%～75%为3，阳性细胞76%～100%为4。染色强度分为0～3级：阴性为0，弱阳性为1，中等强度为2，强阳性为3。积分为二者之和。将积分<2定为阴性表达，≥2分定为阳性表达。CD34标记的MVD计数方法：在低倍镜 (100×)视野下扫视整个组织切片，在肿瘤浸润区域选取染色清晰、背景对比良好、微血管数量最密集的视野即“热点”，然后高倍镜(200×)下计数3个视野内所有染色的微血管数，取平均数为MVD。

　　1.4 统计学方法

　　采用SAS8.1软件，COX-2、NSCLC指标间用χ2分析，Kaplan-Meier法计算生存率。生存曲线比较采用log-rank检验。

　　2 结果

　　2.1 VEGF、COX-2的表达

　　VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质，阳性染色表现为胞浆内均匀棕黄色细颗粒状染色;COX-2蛋白主要表达于肿瘤细胞的胞浆靠近核膜处或整个胞浆，呈棕黄色颗粒状。NSCLC表达阳性率为66.7%(32/48)，COX-2表达阳性率为68.8%(33/48)，经COX-2与VEGF表达直线相关分析，r=0.687, P<0.01，两者呈相关关系。

　　2.2 COX-2、VEGF的表达与MVD的关系

　　CD34标记单个血管内皮细胞和微血管内皮细胞，可见肿瘤组织有较多新生微血管，MVD平均为31.6±8.2。COX-2、VEGF阳性表达和阴性表达的MVD分别为35.7±8.3、25.5±7.6和33.5±8.1、26.7±7.2，差异均有显著性(P<0.05)。

　　2.3 COX-2、VEGF的表达与NSCLC临床病理特征关系

　　见表1。表1 NSCLC临床病理特征与COX-2、VEGF蛋白阳性表达率的关系(略)

　　2.4 COX-2、VEGF表达与NSCLC预后的关系

　　随诊期间死亡33例，平均生存时间29.4个月;2年生存率68.8%，3年生存率为37.3%。COX-2阳性表达和阴性表达患者平均生存时间分别为27.2和33.8个月;log-rank检验COX-2表达阳性组与阴性组的生存曲线，差异有显著性(χ2=3.990, P<0.05)。见图1。

　　3 讨论

　　早期研究发现COX-2与胃炎、胃溃疡及肠炎的黏膜修复有关，近年来其在胃癌、肺癌等肿瘤的发生发展中的作用日益受到重视。COX-2不仅是启动炎症反应的关键酶，而且还可通过促进细胞增殖、抑制凋亡、促进肿瘤新生血管形成、促进肿瘤细胞浸润等机制，参与某些恶性肿瘤的发生和发展过程。COX-2在癌前病变的非典型增生支气管上皮中的表达比正常组织增强，在肺癌组织的阳性表达率为60%～80%，而腺癌比鳞癌阳性率高。本研究结果显示：腺癌和鳞癌组织中COX-2阳性表达率分别为82.6%和52.0%，COX-2的表达与肿瘤的分期有密切关系，随着淋巴结转移和肿瘤分期的进展，COX-2的表达水平增加更为明显。COX-2影响肺癌的预后，与Khuri等[1]的结论相似，即COX-2蛋白低表达的肺癌患者，其术后生存期明显比COX-2蛋白高表达者长。经log-rank检验，COX-2表达阳性与表达阴性患者的生存曲线差异有显著性，提示COX-2表达与肺癌侵袭、转移有关并影响患者的生存，这一结果提示COX-2可能是肿瘤进展的一个重要因素。

　　肿瘤血管是实体肿瘤生长、侵袭和转移的基础，肿瘤微环境刺激肿瘤新血管形成和生长。肿瘤的血管形成不仅与肿瘤细胞的营养和供氧有关，而且也反映了肿瘤的浸润和转移能力，是决定肿瘤大小、转移、复发和预后的重要因素。VEGF是目前已知的作用最强的促血管形成因子之一，VEGF通过对血管内皮细胞的增殖、基膜的水解、迁移和血管构成的调控，与多种肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关，因此VEGF已成为胃癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤的重要预后指标。本实验发现，VEGF表达水平在非小细胞肺癌有淋巴结转移组的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组，VEGF的表达水平是预测非小细胞肺癌预后的重要指标之一。

　　COX-2催化合成的PGs通过诱发新生血管来促进肿瘤生长。在人肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌组织的新生血管内皮中有COX-2的高表达。以前的研究[2]证实COX-2高表达的确能促进肺癌组织血管生成，并有利于肿瘤的生长和转移，增强恶性细胞的侵袭力。在小鼠血管生成模型中，选择性COX-2抑制剂塞来昔布能抑制角膜血管生成，而COX-1抑制剂无此作用[3]，提示COX-2通过许多生化机制，刺激新生细血管生长，促进肿瘤生长。本实验显示COX-2与VEGF的表达呈明显相关性，且COX-2与VEGF表达均阳性者MVD显著高于二者均阴性者，表明COX-2在肺癌中的促癌机制可能通过诱导VEGF表达上调，进而促进血管生成来实现。VEGF生成的影响因素有很多，COX-2可能在VEGF生成的上游影响其表达[4]。COX-2过度表达促进血管生成因子VEGF、bFGF和PDGF等上调，COX-2抑制剂可使这些因子恢复至基础水平。选择性COX-2抑制剂西乐葆3.0mg/kg/d，能使PGE2生成减少78%，TXA2生成减少68%，使血管生成抑制率78.6%，同时细胞增殖降低了65%[5]。NSCLC组织中COX-2阳性表达与VEGF表达呈显著正相关，MVD随COX-2、VEGF表达增强而增高，提示COX-2的高表达可能通过影响VEGF表达上调，促进肿瘤血管形成，增加微血管密度，进而促进肿瘤生长、侵袭和转移，影响肺癌的预后。对于COX-2、VEGF增强表达的肺癌患者，预防性应用COX-2抑制剂、VEGF 受体阻滞剂，抑制肿瘤微血管形成，是否可延长肺癌患者的术后生存时间，有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Khuri FR，Wu H，Lee JJ，et a1.Cyclooxygenase-2 overexpression is a marker of poor prognosis in stage I non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res，2001，7(4)：861～867.

　　2 俞万钧，修清玉，李兵，等. 塞来昔布对Lewis肺癌组织COX-2、VEGF、MVD、MMP-2表达的影响. 肿瘤，2005，25(5)：423.

　　3 Masferrer JL， Leahy KM， Koki AT， et al. Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase-2 inhibitors. Cancer Res， 2000， 60(5):1306～1311.

　　4 Kisley LR， Barrett BS， Bauer AK， et al. Genetic ablation of inducible nitric oxide synthase decreases mouse lung tumorigenesis. Cancer Res， 2002， 62(23):6850～6856.

　　5 Leahy KM. Cyclooxygenase-2 inhibition by celecoxib reduces proliferation and induces apoptosis in angiogenic endothelial cells in vivo. Cancer Res， 2002， 62(3):625～631.