艾迪注射液对裸鼠人胃癌移植瘤细胞凋亡的影响

　　作者：张金娟, 张贵林 作者单位：(1.贵阳医学院 机能实验室， 贵州 贵阳 550004; 2.贵阳医学院 药理学教研室， 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 观察艾迪注射液对裸鼠人胃癌移植瘤细胞凋亡的影响。方法： 将人胃癌细胞BGC823接种于裸鼠右侧腋皮下，建立荷瘤裸鼠模型。将荷瘤裸鼠随机分为：模型、环磷酰胺及艾迪注射液高、中、低剂量5个组，加上1个对照组(未接种肿瘤细胞)，各组动物按各自药物和剂量腹腔注射(ip)给药，连续14 d。末次给药后处死动物，剥取瘤块，用流式细胞仪测定移植瘤组织的细胞凋亡率，并用电子显微镜观察其超微结构。结果： 艾迪注射液高剂量组的细胞凋亡率明显高于模型组，电镜下可见明显的凋亡表现。结论： 艾迪注射液具有促进裸鼠人胃癌移植瘤组织细胞凋亡的作用。

　　【关键词】 肿瘤细胞，培养的; 胃肿瘤; 细胞凋亡; 小鼠，近交BALB C; 艾迪注射液; 人胃癌细胞

　　Effects of Aidi Injection on Cell Apoptosis of Transplanted

　　Human Gastric Cancer in Nude Mice

　　ZHANG Jinjuan1，ZHANG Guilin2

　　(1. Laboratory of Functions, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China; 2.Department of

　　Pharmacology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To observe the effect of Aidi injection (Ad) on apoptosis of transplanted tumor of human gastric cancer in nude mice. Methods: Gastric cancer model of nude mice were established by transplanting human gastric cancer cell line (BGC823) into hypoderm at right armpit, and then the cancerbearing mice were divided randomly into 5 groups: model group, cyclophosphamide (CTX) group, and 3 Ad treated groups (highdose, middledose, and lowdose groups). Physiologic saline (PS), CTX, Ad were given intraperitoneally to mice of different groups respectively for 14 days. A normal negative group was set up composed by nude mice without transplantation and administrated with PS (ip). The mice were sacrificed by decapitation, and the tumor tissues were extracted for observation of apoptosis degree by flow cytometry detection, and cancer cell ultrastructure by electronmicroscope (EM). Results: Tumor inhibitory rate was 61.84% in Aidi high dose group of which the cell apoptosis rate was obviously higher than that of model group (P<0.05). Ultrastructure of cancer cell apoptosis was observed under EM. Conclusions： Aidi injection has effects to apparently increase the apoptosis of human gastric cancer in nude mice.

　　[Key words] tumor cells,cultured; stomach neoplasms; apoptosis; mice,inbred BALB C; Aidi injection; gastric cancer cells

　　以接种人胃癌细胞BGC823的荷瘤裸鼠模型对艾迪注射液的抗癌作用进行了研究，结果表明艾迪注射液对裸鼠的人胃癌移植瘤具有抑制作用[1]。肿瘤的发生发展与细胞凋亡密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的途径之一。体外实验研究发现，艾迪注射液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[2～4]。本实验进一步对裸鼠人胃癌移植瘤组织的细胞凋亡率及超微结构进行了检测，观察艾迪注射液在体内对肿瘤细胞凋亡的影响，以探讨其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 受试药物 艾迪注射液，贵州益佰制药股份有限公司提供，批号：20060807。每支10 ml，每1 ml相当于0.301 5 g生药(剂量按生药计)。

　　1.1.2 瘤株 人胃腺癌细胞BGC823(低分化)，中科院上海细胞库。

　　1.1.3 受试动物 BALB/c裸小鼠，SPF级，7周龄，上海斯莱克实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2003-0003。裸鼠用带过滤罩的鼠盒饲养于清洁级动物室内的层流柜中，饮水、饲料、垫料均作无菌处理。动物室光照充足，温度26～28 ℃，相对湿度40%～60%。

　　1.1.4 其它材料 环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号07083021;改良型RPMI1640培养基：海克隆生物化学制品(北京)有限公司，批号NSE0042;优级胎牛血清：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;DJ系列洁净动物饲养柜(空气层流柜)：苏杭实验动物科技发展公司;超净工作台：苏州净化设备有限公司;CO2培养箱： 2001HY6003型，Thermo Forma公司;倒置显微镜：CK40型，日本Olympus公司;流式细胞仪：美国 Betcton Dickinson公司;透射电子显微镜：TECNAI10型，荷兰PHILIPS 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 建立荷瘤裸鼠模型 将人胃癌细胞BGC823于含体积分数10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中 (内含青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/L)，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。收集对数生长期细胞，用0.4%台盼蓝染色、检测细胞活力高于95%。调整成浓度为1×107/ml的细胞悬液。无菌条件下将细胞悬液以0.2 ml/只接种于裸鼠右腋皮下，继续饲养2周，建立荷瘤裸鼠模型。

　　1.2.2 分组给药 将荷瘤裸鼠按瘤块大小随机分为：模型(等容积生理盐水)、环磷酰胺(20 mg/kg)、艾迪注射液高剂量(9.45 g/kg)、艾迪注射液中剂量(4.72 g/kg)、艾迪注射液低剂量(2.36 g/kg)5个组，加上对照组(不接种肿瘤细胞，等容积生理盐水)实验动物共分为6个组，每组6只。环磷酰胺隔日ip 1次，其余各组均按各自药物和剂量每天ip 1次，连续14 d。

　　1.2.3 移植瘤细胞凋亡率测定 末次给药后次日，脱颈椎处死动物，剖取瘤体组织(对照组取肺组织)，取部分剥离的瘤组织置于-20 ℃冰箱中保存备用。将保存的瘤组织在常温下解冻后，按常规方法制成单细胞悬液;离心，弃上清液，加入RNA酶150 μl，37 ℃水浴中消化15～20 min，用PBS液将细胞浓度调整至1×109个/L，加入DNA结合性荧光染料碘化丙啶100 μl(50 mg/L)染成淡橙色，10 min后上机检测细胞凋亡率。以正常裸鼠肺组织细胞作对照，平行操作[5]。数据用Modifit LT 2.0软件分析处理。

　　1.2.4 移植瘤组织超微结构观察 取部分剥离的瘤组织以2.5%戊二醛固定，用0.1 mol/L PBS漂洗2次，1%锇酸固定2 h，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，铀染色、铅染色，透射电镜下观察其超微结构。

　　2 结果

　　2.1 对移植瘤组织细胞凋亡的影响

　　流式细胞仪检测结果显示，各组瘤组织细胞凋亡率均大于对照组肺组织。给药组肿瘤组织的细胞凋亡率均大于模型组，其中环磷酰胺组及艾迪注射液高剂量组的凋亡率均明显高于模型组，差异显著(P<0.05， P<0.01)。见表1。表1 艾迪注射液对人胃癌裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响(1)与对照组比较，P<0.01;(2)与模型组比较，P<0.05，(3)P<0.01

　　2.2 移植瘤组织的超微结构观察

　　电镜下可见，模型组：染色质块状边集;高剂量组：在较多视野下可见正常细胞结构破坏，大量核碎片;中剂量组：染色质呈环状浓缩，有部分核碎片，胞质表面突起;低剂量组：部分染色质边集，可见核碎片，线粒体正常。以上变化均为细胞凋亡的形态学改变。见图1。图1 移植瘤组织的超微结构(×10 000)

　　3 讨论

　　细胞凋亡(apoptosis)主要是指在各种因素调控下发生的细胞自然死亡行为，它贯穿于生命全过程，是生命进化过程中形成的保守的基本生命活动之一，是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种自我调节机制[6]。自1972年由kerr等[7]首先提出凋亡概念并对其形态进行了描述。其后人们在对凋亡形态、基因蛋白调控等方面开展的大量深入研究中，发现肿瘤的发生和发展不仅与细胞增殖异常有关，而且与细胞凋亡的紊乱也密切相关[8]。异常细胞的凋亡受到抑制，正常情况下应该凋亡的细胞继续存活，导致组织内稳态失去正常的调控，细胞数目不能保持相对的恒定，呈生长趋势，细胞恶性生长、不能维持细胞数量的适当平衡是肿瘤的基本特征。目前发现许多常见的肿瘤化疗药物如烷化剂、紫衫醇等均可诱导肿瘤细胞凋亡[9,10]。随着凋亡机制的探讨，促进肿瘤细胞的凋亡已成为肿瘤治疗的一种思路。

　　流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)是目前检测细胞凋亡常用的有效手段，电子显微镜可以观察到细胞凋亡的形态学改变。本研究中以流式细胞仪测定裸鼠移植瘤的细胞凋亡率，并以透射电镜观察移植瘤组织超微结构。流式细胞仪检测结果显示各实验组移植瘤细胞凋亡率均远远高于对照组裸鼠肺组织细胞，瘤细胞凋亡率明显高于正常组织，这符合瘤细胞增殖快、凋亡也快的生物学特点。其中各给药组凋亡率均高于模型组，环磷酰胺组及艾迪注射液高剂量组的细胞凋亡率与模型组比较差异显著(P<0.05)。透射电镜下可观察到各组移植瘤组织均有凋亡的形态学改变，其中以艾迪注射液高剂量组的凋亡较为明显。流式细胞仪及电镜检测结果均反映艾迪注射液具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

　　肿瘤的发生发展是一个多因素、多环节、复杂的病理过程，抗肿瘤药物亦可以从多环节、多靶点发挥作用，综合实验结果，艾迪注射液促进肿瘤细胞凋亡的作用可能是其抑瘤作用的机制之一。艾迪注射液可能存在的其它作用机制还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]张金娟，温彩兰，张贵林.艾迪注射液对裸鼠人胃癌移植瘤的抑瘤作用研究[J].贵阳医学院学报，2009(6)：662-664.

　　[2]唐斓,曾凡波,王涛,等.艾迪注射液抑制肿瘤细胞生长及诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J].中国药师,2006(3):198-200.

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　　[4]刘德艳,李辅军,王常玉,等. 艾迪注射液及联合应用化疗药物抑制人卵巢癌细胞株A2780增殖的研究[J]. 现代妇产科进展,2005(1):47-49.

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　　[7]Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implication in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972(2):239.

　　[8]Ryungsa Kim, Kazuaki Tanabe, Yoko Uchida, et al. Current Status of the molecular mechanisms of anticancer drug induced apoptosis. The contribution of molecular level analysis to cancer chemotherapy [J].Cancer Chemother Pharmacol, 2002 (5):343-352.

　　[9]SchulteHermann R, Bursch W, GraslKraupp B. Relevance of apoptosis for carcinogenesis[J].Verh Dtsch Ges Pathol,1994 (6)：15-21.

　　[10]葛明，万毅刚，甄彦君，等.华蟾素注射液和艾迪注射液治疗晚期肺癌的对比研究[J].实用临床医药杂志，2007(1)：11.