cmyc 反义核酸对乳腺癌MCF7细胞生长及hTERT基因表达的影响

　　作者：马莉 作者单位：646000 泸州，四川省泸州医学院医学生物学与遗传学教研室

　　【摘要】 目的 探讨脂质体介导cmyc基因反义寡核苷酸(Antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide，ASODN)对MCF7细胞生长及其人体端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因表达的影响。 方法 将cmyc正、反义寡核苷酸(ODN)分别导入各组MCF7细胞中，MTT法、逆转录聚合酶链法及流式细胞术分别检测各组细胞生长情况、hTERT mRNA的表达水平以及细胞凋亡率。结果 cmyc ASODN转染MCF7细胞24h后，细胞生长受到抑制(P<0.05)，并且hTERT mRNA表达明显降低;随着反义核酸作用时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增多，细胞生长及hTERT表达的下降随时间延长逐渐明显。对照组、LRSODN组、LRASODN 24h组与LRASODN 48h、72h组相比有明显统计学差异(P<0.05)。结论 cmyc反义寡核苷酸能显著下调细胞中hTERT基因的表达活性，诱导MCF7细胞凋亡，并抑制MCF7细胞生长;在一定程度上，其效果与时间呈正相关。

　　【关键词】 乳腺肿瘤 cmyc 人端粒酶逆转录酶 反义核酸 MCF7细胞

　　端粒酶是维持染色体结构和功能稳定的一种核糖核蛋白复合体，在几乎所有的人类恶性肿瘤细胞中均高表达[1]。其最重要的成分是人端粒酶催化亚单位，又称人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)，被认为是端粒酶激活的限速因素。随着hTERT基因克隆[2]成功，对其的调控研究成为端粒酶研究的重点。

　　cmyc是一类参与细胞增殖与分化的原癌基因，通过基因扩增、逆转录酶插入和染色体易位等方式表达失调，在大多数的肿瘤中都有高水平的表达[3，4]，并且cmyc是第一个被发现的调节hTERT基因表达的重要转录因子[5]。许多研究报道，在恶性肿瘤细胞中cmyc与hTERT 的表达密切相关。Oh 等[5]报道，与正常细胞相比，myc蛋白在肿瘤细胞中表达显著增高;激活或抑制myc蛋白表达可以改变hTERT启动子活性，认为myc蛋白对hTERT启动子的调节作用可能与其促进肿瘤形成有关。而目前也有研究显示[6]，cmyc与hTERT的表达调控无明显相关性。由此可见，研究者们对于cmyc与hTERT的表达调控关系仍持不同意见。

　　本研究选用cmyc和hTERT均高表达的乳腺癌MCF7细胞，采用Lipfect AMINETM介导的反义核酸技术将cmyc反义核酸转染入MCF7细胞，观察细胞生长抑制、细胞凋亡以及hTERT基因表达的变化，为针对端粒酶抑制的乳腺癌肿瘤基因治疗提供理论依据，并从逆向角度进一步探讨cmyc对hTERT基因表达的调控作用。

　　1材料与方法

　　1.1 细胞培养

　　采用含5% FBS(60℃灭活30min)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养人乳腺癌MCF7细胞系。实验选用指数生长期细胞。

　　1.2cmyc正、反义寡核苷酸转染

　　cmyc 正、反义寡核苷酸由上海Sangon公司合成并行全硫代磷酸化修饰，经NCBI blast证实与人类其他已知基因无同源性。序列分别为：反义序列(ASODN)：5′AAC GTT GAG GGG CAT3′;正义序列(SODN)：5′ATG CCC CTC AAC GTT3′。将细胞分为对照组、LRSODN组与LRASODN组。转染按照文献报道[7]中所述，并有些改动：ASODN和SODN的终浓度均为2.5μmol/L，脂质体相对浓度为10%;对照组细胞只加同量培养基。

　　1.3MTT法检测细胞生长的情况

　　取出cmyc SODN 及ASODN分别作用24h、48h、72h后的各组细胞,每孔加入终浓度为5mg/ml的MTT溶液200μl，5h后加入DMSO溶解振荡10min，酶标仪测570nm波长的OD值。绘制各组细胞存活率曲线。细胞抑制率(%)=(1-处理组OD值/ 对照组OD值)×100%。实验重复5次。

　　1.4 RTPCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平

　　hTERT基因PCR扩增引物参照Takakura等的方法设计，并经GenBank检索证实，hTERT上游引物序列：5′CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA3′;hTERT下游引物序列：5′GGA TGA AGC GGA GTC TGG A3′，扩增片段长度为145bp。内对照β肌动蛋白(βactin)基因扩增片段长度为540bp。上述引物均由上海Sangon公司合成。

　　分别收集上述各组MCF7细胞，提取总RNA后，采用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取样品完整性。按照MMLV一步法RTPCR进行扩增反应，以β肌动蛋白(βactin)作为内对照，设置50μl反应体系：模板RNA 1μl、2×反应混合液25μl、MMLV/Taq Mix 1μl、hTERT上下游引物均 1μl、内对照βactin基因上下游引物均0.3μl，加无菌双蒸水至50μl。37℃ 30min，94℃ 2min;94℃ 15sec，57℃ 30sec，68℃ 90sec，35个循环，最后68℃ 5min。扩增产物在1.7%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶图象分析仪分析RTPCR产物的电泳结果，用hTERT与βactin的灰度扫描比值表示hTERT mRNA相对表达量，实验重复5次。

　　1.5AnnexinⅤFITC/PI双染色法流式细胞计数仪检测分析转染细胞凋亡情况

　　AnnexinⅤFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Biovision公司。用0.25%的胰酶消化收集各组细胞，冷PBS洗涤2次，1×AnnexinⅤ缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106 /ml，取100细胞悬液(1×105细胞)加入5μl AnnexinⅤFITC和5μl PI，混匀，于暗处室温孵育15min。每管加入400μl 1×AnnexinⅤ缓冲液，过滤后在1h内进行流式细胞仪检测。AnnexinⅤ阳性/PI阴性判断为早期凋亡。实验重复5次。

　　1.6统计学分析

　　数据采用±s表示，进行单因素方差分析，均由SPSS11.0软件统计包完成。检验水准：α=0.05。

　　2结果

　　2.1不同处理组对MCF7细胞生长的影响

　　经LR介导反义cmyc作用24h后，细胞生长出现抑制;作用48h后，细胞生长抑制率明显升高。将各组OD值进行比较显示： LRASODN 24h、48h、72h组与空白对照组、LRSODN 组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与LRSODN 组比较,无统计学差异(P>0.05)，见表1。表1 LR介导cmyc正反义寡核苷酸对MCF7细胞生长的影响与对照组、LRSODN各组相比，P<0.05;*与对照组、LRSODN各组及LRASODN 24h组相比，P<0.012.2cmyc ASODN对MCF7细胞hTERT mRNA表达水平的影响

　　MMLV一步法RTPCR反应扩增后，凝胶电泳紫外灯下直接观察，各组在100bp DNA ladder Marker 145bp处见明暗不一的hTERT扩增产物，于540bp处可见明暗一致的内对照βactin扩增产物，见图1。紫外凝胶成像灰度扫描后，进行单因素方差分析，结果显示：ASODN作用于MCF7细胞24、48、72h时hTERT mRNA相对表达量分别与对照组、LRSODN组相比，差异有统计学意义(P<0.01);而SODN作用于MCF7细胞24、48、72h hTERT mRNA相对表达量分别与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。并且在一定范围内，LRASODN各组hTERT mRNA相对表达量随时间的递增而明显降低，见表2。

　　M：100bp DNA ladder Marker; 1：LRASODN处理72h组; 2：LRASODN 处理48h组; 3：LRASODN处理24h组; 4：LRSODN处理72h组;5：LRSODN处理48h;6：LRSODN处理24h; 7：对照组表2 LR介导cmyc正反义寡核苷酸对MCF7细胞凋亡及hTERT基因表达的影响#与对照组及LRSODN各组相比，P<0.05;*与对照组及LRSODN各组相比，P<0.01;Δ与对照组、LRSODN各组及LRASODN 24h组相比，P<0.01;※与对照组、LRSODN各组及LRASODN其他组相比，P<0.012.3流式细胞计数仪检测分析不同作用时间段转染细胞凋亡情况

　　MCF7细胞经LR介导反义cmyc处理后，流式细胞仪检测显示在一定范围内，随着时间的延长，细胞凋亡率明显增高，见表2。统计学分析显示：对照组、LRASODN 24h组及LRSODN各组之间无统计学差异(P>0.05);LRASODN 48h、72h组与对照、LRASODN 24h及LRSODN各组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3讨论

　　hTERT基因表达的上调是端粒酶激活的主要途径，而cmyc是参与hTERT调控的重要因子，它能通过激活hTERT的表达而导致肿瘤发生。分析hTERT序列发现[8,9]，hTERT基因结构的内含子和启动子序列中有多个转录因子的潜在结合位点，其中 cmyc可与hTERT基因启动子E盒结合，激活靶基因的转录，从而影响端粒酶活性的表达及细胞的增殖和分化。林勇等[10]利用瞬时转染实验，采用在脂质体LipfectAMINETM(LR)介导下，将含有cmycDNA质粒分别转染入肝癌细胞HepG2、猴肾COS7细胞和NIH3T3细胞，结果发现cmyc可以直接激活hTERT启动子的表达，且cmyc的激活作用与其剂量呈正相关。Oh等[5]还应用cmyc反义核酸作用Hela细胞，发现cmyc和hTERT基因表达均下降且两者呈平行关系。

　　本研究用相对定量RTPCR检测反义cmyc作用MCF7细胞后hTERT mRNA表达水平，发现：cmyc SODN作用于MCF7细胞24h、48h、72h后，hTERT mRNA表达均无明显变化(P>0.05);而cmyc ASODN作用于MCF7细胞24h后，hTERT mRNA相对表达量即出现明显下降，抑制率达25%，作用48h、72h后抑制率进一步升高，分别为62%和80%，与对照组相比均存在统计学差异(P<0.01)。可见抑制效果随时间的延长逐渐增强。这一结果进一步证明，cmyc是hTERT基因表达的重要调控因子。cmyc高表达上调hTERT基因表达水平，进而上调端粒酶活性，这是端粒酶活性调节的重要机制。

　　另外，在本实验中发现，cmyc反义寡核苷酸作用于MCF7细胞72h后，hTERT mRNA表达量仍可达到0.143±0.011，抑制率为80%，即hTERT基因表达未被完全抑制，与林勇等[10]得出的结论相符。表明cmyc反义核酸只能下调hTERT基因表达，并不能完全封闭该基因。这一结果进一步证明cmyc对hTERT的调控不是唯一的影响因素。

　　虽然hTERT启动子区有E盒与cmyc相互作用，且目前许多研究结果也都有证实,但有研究在应用RTPCR方法检测乳腺癌组织中端粒酶与cmyc mRNA[11]及hTERT mRNA与cmyc mRNA表达水平时[6]，发现cmyc mRNA与端粒酶表达之间无明显关系，而且hTERT mRNA与cmyc mRNA表达之间亦无明显关系。而且在乳腺癌组织中hTERT蛋白与cmyc蛋白表达之间也不存在明显关系[12]。因此，作者认为hTERT的调控无疑是非常复杂的，要结合其他的细胞调控途径综合评价。例如有研究者就指出[13]，Mad1可作为myc调控途径的一个因子，抑制hTERT的转录水平。因此要了解hTERT与cmyc的调控关系究竟是怎样的，还应结合细胞和组织两个水平进一步证实。

　　近年来许多研究表明，端粒酶及其催化亚基-hTERT活性下调后，端粒序列不完全复制，导致随着细胞分裂端粒重复片段的丢失，进而肿瘤细胞染色体不稳定，诱导DNA损伤反应，细胞周期受阻，最终肿瘤细胞发生凋亡或死亡。本实验中，c–myc反义核酸转染乳腺癌MCF7细胞后，24、48、72h时各组细胞抑制率分别为5.85%、32.18%、62.47%;流式细胞仪定量检测反义cmyc寡核苷酸作用24、48、72h时，各组细胞凋亡率为4.64%、13.50%、28.76%，凋亡指数明显高于正常对照组细胞。结果表明，脂质体介导的反义cmyc下调hTERT基因表达的同时，能有效抑制MCF-7细胞生长，并诱导细胞凋亡，在一定程度上，其效果与时间呈正相关。经流式细胞仪检测发现，早期坏死细胞比例并没有升高，说明ASODN对细胞的抑制并不是直接的细胞毒作用，而是反义核酸的反义作用效应。而Yamaguchi等[14]用hTERT的反义载体转染到神经胶质瘤细胞后，出现端粒酶活性受到抑制，但转染后2个月仍未出现细胞死亡。以上结果表明除了影响端粒的长度外，端粒酶还可能通过其他途径(例如半胱氨酸蛋白激酶家族成员瀑布式的信号传导通路)参与细胞凋亡，从而导致细胞凋亡发生的速度各不相同。

　　端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤细胞中最广谱的分子标记，在绝大多数肿瘤细胞中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达，因此端粒酶是进行肿瘤基因治疗的理想靶点。在肿瘤基因治疗研究中，结合本研究结果，作者认为靶向cmyc针对端粒酶抑制的肿瘤基因治疗是一种有效的基因治疗策略。但是在肿瘤细胞中，端粒酶活性的调控是多因子、多水平、多阶段进行的，在不同种类细胞中，端粒酶的激活机制不尽相同，因此端粒酶的靶向基因治疗尚需针对多靶基因、多途径进一步深入探讨。

　　【参考文献】

　　[1] Perry PJ,Amold JR,Jenkins TC,et al.Telomerase inhibitors for the treatment of cancer:the current perspective [J].Expert Opin investing Drugs,2001,10(12):12411256.

　　[2] Kirkpatrick KL,Mokbel K.The significance of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in cancer[J].Eur J Surg Oncol,2001,27(8):754760.

　　[3] Rothermund K,Rogulski K,Fernandes E,et al.CMycindependent restoration of multiple phenotypes by two CMyc target genes with overlapping functions[J].Cancer Res,2005,65 (6): 20972107.

　　[4] O'Connell BC,Cheung AF,Simkevich CP,et al.A large scale genetic analysis of cmyc regulated gene expression patterns[J].J Biol Chem,2003,278(14):1256312573.

　　[5] Oh S,Song YH,Kim UJ,et al.In vivo and in vitro analyses of Myc for differential promoter activities of the human telomerase (hTERT) gene in normal and tumor cells [J].Biochem Biophys Res Comun,1999,263(2):361365.

　　[6] Kirkpatrick KL,Ogunkolade W,Elkak AE,et al.hTERT expression in human breast cancer and noncancerous breast tissue: correlation with tumour stage and cMyc expression[J].Breast Cancer Res Treat,2003,77(3):277284.

　　[7] 张莉娟,税青林,何国平,等.脂质体介导反义核酸对乳腺癌MCF7细胞增殖的影响[J].中国应用生理学杂志,2005,21(3):338339,355.

　　[8] Cerni C.Telomeres,telomerase,and myc.An update[J].Mutat Res,2000,462 (1): 3147.

　　[9] Kondo Y,Koga s,Komata T,et al.Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 25antitelomerase RNA component [J].Oncogene,2000,19(18):22052211.

　　[10]林勇,谢渭芬,陈伟忠,等.cmyc调节人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子活性的体外研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2001,8(1):3436.

　　[11]Kirkpatrick KL,Newbold RF,Mokbel K.There is no correlation between cmyc mRNA expression and telomerase activity in human breast cancer[J].Int Semin Surg Oncol,2004,1(1):26.

　　[12]Elkak AE,Meligonis G,Salhab M,et al.hTERT protein expression is independent of clinicopathological parameters and cMyc protein expression in human breast cancer[J].J Carcinog,2005,4:1722.

　　[13]Gunes C,Lichtsteiner S,Vasserot AP,et al.Expression of the hTERT gene is regulated at the level of transcriptional initiation and repressed by Mad1[J].Cancer Res,2000,60(8):21162121.

　　[14]Yamaguchi F,Morrison RS,Takahashi H,et al.Antitelomerase therapy suppressed glioma proliferation[J].Oncol Rep,1999,6(4):773776.