MMP12基因多态性与食管癌、贲门癌发病风险的关联

　　作者：张晓娟，王 娜，周荣秒，董秀娟，李 琰 作者单位：石家庄，河北医科大学第四医院(河北省肿瘤研究所)分子生物学室

　　【摘要】 目的 本研究旨在探讨基质金属蛋白酶12(MMP12)基因启动子区转录起始点上游82bp处A/G单核苷酸多态性(SNP)与河北省食管癌、贲门癌高发区—磁县、涉县食管鳞状细胞癌(ESCC)和贲门腺癌(GCA)遗传易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术检测316名ESCC患者、243名GCA患者和609名健康对照的MMP12 A82G SNP的基因型。结果 MMP12 SNP的基因型及等位基因频率在两患者组与健康对照组之间，其总体分布差异无统计学意义(P>0.05)。根据吸烟状况分层分析发现，吸烟组中GCA患者组与对照组A/A、A/G基因型频率分别是89.8%、10.2%和95.0%、5.0%，GCA患者组A/G基因型频率虽明显高于对照组，但两组相比差异无统计学意义(χ2=3.43, P=0.06)，与A/A基因型相比，携带A/G基因型有增加吸烟个体GCA发病风险的趋势(OR=2.13, 95% CI=0.94～4.83)。结论 MMP12基因A82G SNP可能与河北省磁县和涉县人群的食管癌、贲门癌发病风险无关;但携带A/G基因型可能是吸烟人群GCA发病的危险因素。

　　【关键词】 食管鳞状细胞癌;贲门腺癌;MMP12;基因多态性;肿瘤易感性

　　Correlation of MMP12 Polymorphism to Risk of Squamous Cell Carcinoma and Gastric Cardiac Adenocarcinoma

　　ZHANG XiaoJuan, WANG Na, ZHOU RongMiao, DONG XiuJuan, LI Yan

　　Division of Molecular Biology, The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China

　　Corresponding Author: LI Yian, Email:lykx1962@yahoo.com.cnAbstract：Objective This study was designed to investigate the correlation of MMP12 A82G single nucleotide polymorphism (SNP) with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and gastric cardiac carcinoma (GCA) in a population of high incidence region of Hebei Province. Methods MMP12 promoter SNP (A82G) was genotyped by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) analysis in 316 ESCC patients, 243 GCA patients and 609 healthy controls. Results The overall genotype and allelotype distributions of MMP12 in ESCC and GCA patients were not significantly different from those in healthy controls (P>0.05). When stratified for smoking status, the A/A, A/G genotype frequencies of MMP12 in GCA patient and healthy controls of smoker group were 89.8%, 10.2% and 95.0%, 5.0% respectively, there was difference between two groups but no significant statistical difference(χ2=3.43，P=0.06).And the A/G genotype frequencies of MMP12 in GCA patients were significantly higher than those in healthy controls, compared with A/A genotype, individuals with A/G genotype have a tendency of increasing susceptibility to GCA in smoker group (OR=2.13, 95% CI=0.94～4.83).Conclusions In high incidence region of Hebei Province, the overall genotype and allelotype distributions of MMP12 A82G in ESCC and GCA patients were not significantly different from those in healthy controls; and in smoking individuals, A/G genotype probably is a risk factor for GCA.

　　Key words：Esophageal squamous cellcarcinoma; Gastric cardiac adenocarcinoma; MMP12; Polymorphism; Susceptibility

　　基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一个锌依赖性的蛋白水解酶家族，它能够降解细胞外基质有效成分、调节细胞粘着、维持肿瘤微环境，在肿瘤浸润转移过程中起重要作用。另一方面也可能通过调节细胞的增殖与凋亡、改变细胞的微环境及调节血管形成等参与肿瘤的发生过程[13]。MMP12是这个家族中的一员，又称巨噬细胞弹性蛋白酶或金属弹性蛋白酶，其底物是多种细胞外基质和非细胞外基质成分。MMP12基因启动子区转录起始点上游82bp处存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，体外实验表明此处的SNP可通过改变基因转录活性而影响该蛋白的表达[4]，有关MMP12 A82G SNP与食管癌、贲门癌易感性关系的研究尚未见报道。

　　本研究应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)分析方法，探讨MMP12 A82G SNP对河北省食管癌、贲门癌高发区—磁县和涉县人群食管鳞状细胞癌、贲门腺癌的易感性的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　316名食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)患者、243名贲门腺癌(gastric cardiac adenocarcinoma, GCA)患者均来自河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县的癌前普查，609名健康对照为在相同地区和同一时间、通过癌前普查获得，所有研究对象均知情同意本项研究，由专门人员调查登记所有研究对象的性别、年龄、吸烟史及上消化道肿瘤家族史。将现吸烟或曾吸烟每天5支以上并持续两年或两年以上者定义为吸烟个体。将家族中有1名以上一级亲属和(或)2名以上二级亲属患有食管癌/贲门癌/胃癌者定义为上消化道肿瘤(upper gastrointestinal cancer, UGIC)家族史阳性。

　　1.2 标本采集及外周血白细胞DNA的提取

　　所有研究个体均采集外周静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，4℃冰箱保存。并在采血后一周内以蛋白酶K消化饱和氯化钠盐析法[5]提取外周血白细胞DNA。

　　1.3 MMP12 A82G SNP基因分型

　　MMP12 A82G基因型检测应用PCRRFLP方法进行。PCR反应体系为20μl，其中模板DNA 100ng，10×PCR缓冲液2μl，染料2μl，Taq DNA聚合酶(北京赛百盛生物有限公司)2.5U，dNTPs 200μM，上游引物(5′ GAGATAGTCAAGGG ATGATATCA 3′)和下游引物(5′AAGAGCTCCAGAAG CAGTGG3′)各200nM，MgCl2(25nM)1.2μl。PCR反应条件为：94℃预变性10min，然后94℃变性45s、57℃退火45s、72℃延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳为199bp，经限制性内切酶PvuⅡ(大连宝生物工程有限公司)37℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。A/G基因型存在PvuⅡ的识别位点，经酶切后表现为199bp、175bp和24bp三条DNA片段，而A/A基因型缺乏PvuⅡ的识别位点仅有一个199bp的片段，见图1。

　　为进行基因型检测的质量控制，每一批PCR反应均以灭菌双蒸水替代模板DNA作为阴性对照，并随机挑取10%DNA标本进行重复实验。

　　1.4 统计学方法

　　用卡方检验比较基因型频率的观察值与预期值，并进行HardyWeinberg平衡分析。病例组和对照组的MMP12基因型及等位基因型分布比较采用行×列表的卡方检验进行。应用非条件Logistic回归模型计算表示相对风险度的比值比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(confidence interval, CI)，以P<0.05为差异有统计学意义。统计分析采用SPSS11.5软件包进行。

　　2 结果

　　2.1 一般特征

　　ESCC患者组、GCA患者组与对照组之间性别、年龄构成相似(P>0.05)。ESCC患者组、GCA患者组中吸烟个体比例与对照组相比差异无统计学意义(χ2=0.53和2.70, P=0.47和0.10)。ESCC患者组、GCA患者组中UGIC家族史阳性个体比例分别为49.4%、50.2%，显著高于对照组36.0%(χ2=15.51和14.68, P值均为0.00)，表明UGIC家族史可能增加ESCC和GCA的发病风险(经性别和年龄校正后的OR=1.74和1.77, 95% CI=1.32～2.29和1.31～2.39)，见表1。

　　所有标本均成功进行了基因型分型，所有重复分型结果均与原结果相符。经卡方检验，健康对照组MMP12 A82G 基因型分布符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)。

　　2.2 MMP12 A82G SNP与ESCC、GCA的关系

　　MMP12 A82G SNP在ESCC患者组、GCA患者组与对照组中A/A、A/G和G/G基因型频率分别为96.2%、3.8%、0，93.4%、6.6%、0和94.1%、5.9%、0。MMP12 A82G SNP的A/A和A/G的基因型频率在ESCC患者组、GCA患者组与对照组之间差异无统计学意义(χ2=1.89和0.14, P=0.17和0.71)。在ESCC患者组、GCA患者组与对照组中A和G的等位基因频率分别为98.1%、1.9%，96.7%、3.3%和97.0%、3.0%。A和G的等位基因频率在ESCC患者组、GCA患者组及对照组之间差异亦无统计学意义(χ2=1.84和0.13, P=0.18和0.72)，见表1。表1 食管癌、贲门癌和对照组人口学分布及根据吸烟状况分层分析发现，吸烟组中GCA患者组与对照组A/A、A/G基因型频率分别是89.8%、10.2%和95.0%、5.0%，GCA患者组A/G基因型频率虽明显高于对照组，但其两组间差异无统计学意义(χ2=3.43, P=0.06)。与A/A基因型相比，A/G基因型增加吸烟个体GCA的发病风险的相对风险度OR值为2.13(95% CI=0.94～4.83)。吸烟组中ESCC患者组A/A、A/G基因型频率为96.0%、4.0%，与对照组基因型频率之间无显著性差异。与A/A基因型相比，A/G基因型对吸烟组人群ESCC的发病风险并无影响(OR=0.78, 95% CI=0.27～2.24)。也未发现MMP12基因 A82G SNP对非吸烟组人群ESCC、GCA发病风险的影响(OR=0.55, 95% CI=0.23～1.30和OR=0.47, 95% CI=0.16～1.39)。另外在根据上消化道肿瘤家族史分层分析中，未发现MMP12基因A82G SNP与ESCC、GCA发病风险之间存在关联，见表2。

　　3 讨论

　　食管癌和贲门癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，我国河北省的磁县和涉县为食管癌、贲门癌等上消化道肿瘤的高发地区。研究表明，环境因素与食管癌、贲门癌的发生密切相关，但是暴露于相同环境因素的人群却只有少数人发病，提示个体之间存在遗传易感性的差异，并且这种易感性差异在肿瘤发生发展中起重要作用。本研究显示，UGIC阳性家族史可增加ESCC和GCA的发病风险，进一步证实了遗传背景在这两种肿瘤的发病过程中可能起重要作用，也提示有上消化道肿瘤家族史的人群，应定期检查以发现早期病变。

　　MMPs是一个高度依赖于锌的蛋白水解酶家族，与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。大多数MMPs成员表达和活性的增高与几乎所有人类恶性肿瘤的阶段进展、侵袭性增强和生存期缩短有关[1,6]。MMP12能够降解多种细胞外及非细胞外基质蛋白成分[7]，一方面它通过分解纤溶酶原和Ⅴ型、ⅩⅢ型胶原产生血管抑素和内抑素抑制血管生成[1,89]，另一方面，它还能分解细胞外基质结构成分如Ⅳ型胶原和纤维蛋白促进血管生成。有报道显示在某些肿瘤中MMP12表达增高可以使病人具有良好的预后[1]。

　　MMP12 A82G多态位于MMP12基因启动子区转录因子激动蛋白1(AP1)结合区域，体外实验表明A等位基因与AP1结合能力高导致MMP12启动子活性增高从而使该基因表达增高[4]。本研究的统计结果显示MMP12基因A82G SNP与河北省磁、涉县人群的食管癌、贲门癌发病风险无关;但与A/A基因型相比，携带A/G基因型有增加吸烟个体GCA发病风险的趋势(OR=2.13, 95% CI=0.94～4.83)。而Kader 等[10]报道携带G等位基因可显著增加吸烟人群膀胱癌的转移能力(OR=2.32, 95% CI=1.30～4.12) ，另外Su 等[11]也有研究显示携带G等位基因有增加男性人群肺癌的发病风险的趋势(OR=1.20, 95% CI= 0.91～1.59)。由于本研究中吸烟人群均为男性，因此本研究结果与以上研究具有一致性。本研究结果中基因型频率分布G/G基因型为0，这与张荣葆等[12]对中国北方汉族人群的研究和Shin等[13]对中国上海女性乳腺癌的研究中的MMP12 A82G SNP基因分型结果一致。由于所研究人口中G等位基因频率极低(3.0%)，这种基因型的不均衡分布也会降低统计学效力，而我们的部分结果又是在分层分析后样本量较小的基础上得到的，因此有待于扩大样本量进一步研究证实这种趋势。Yang等[14]报道MMP12在结直肠癌中的过表达与延长病人存活期和减少肿瘤血管形成有关，与此类似，Kerkel等[15]的研究也表明MMP12在肿瘤部位巨噬细胞中的表达与高分化的肿瘤细胞相关。这些研究显示，MMP12可能通过分解纤溶酶原和Ⅴ型、ⅩⅢ型胶原产生血管抑素和内抑素抑制血管生成的作用对组织癌变起到防护作用[1617]。因此我们推测启动子区上游82bp处基因型为A/G的MMP12基因比基因型为A/A表达降低，可能使MMP12的防护作用减弱，从而增加了个体 GCA的发病风险。

　　本研究结果显示MMP12 A82G SNP只有与吸烟人群GCA发病有关的趋势，这一结果尚需进一步研究证实。其中是否存在此多态与吸烟或其他环境和遗传因素的协同作用以及与ESCC、GCA患者肿瘤浸润程度、转移复发和预后的关系，其生物学机制还有待于继续研究。

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