三氧化二砷抑制人结肠癌裸鼠肝转移的药效动力学
发表时间:2010-04-28 浏览次数:454次
作者:孙华君, 姜立新, 董国生, 郭吉田, 吕忠船, 郑海涛, 陈红兵 作者单位:264000 山东青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院腹部外科
【摘要】 目的 研究三氧化二砷(As2O3)对人结肠癌裸鼠肝转移的抑制作用。方法 BALB/Cnu/nu裸鼠经脾脏接种人结肠腺癌LS174T细胞建立结肠癌裸鼠肝转移模型,于10min(早期)、10天(中期)、20天(晚期)经尾静脉注射As2O3,对照组注射生理盐水。观察各组裸鼠体重变化、肝转移结节的数目、大小、瘤重以及肝脏肿瘤替代率和荷瘤鼠的生存时间。结果 与对照组相比,早期及中期治疗组裸鼠肝转移结节的数目、大小、瘤重以及肝脏肿瘤替代率和荷瘤鼠的生存时间差异均有统计学意义(P<0.05),晚期治疗组差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 三氧化二砷对人结肠癌裸鼠肝转移有明显的抑制作用,早期效果优于中晚期。
【关键词】 裸鼠;结肠癌;肝肿瘤;继发性;三氧化二砷
Inhibitory Effect of As2O3 on Liver Metastasis from Human Colon Cancer in Nude Mice
SUN Huajun,JIANG Lixin,DONG Guosheng,GUO Jitian,LV Zhongchuan,ZHENG Haitao, CHEN Hongbing
Department of Abdomen Surgery,The Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University Medical College,Yantai 264000, China
Corresponding Author: CHEN Hongbing, Email:chb2087@ sina.comAbstract:Objective To explore the inhibitory effect of As2O3 on liver metastasis from human colon cancer in nude mice.Methods BALB/Cnu/nu nude mice model of liver metastasis from colon cancer was established.As2O3 was injected into nude mice 10 minutes,10 days and 20 days after the animals inflicted with liver metastasis from colon cancer.The weight of the nude mice,the number,size and weight of the hepatic metastatic lesions,the percentage of hepatic replacement by tumour and the survival period were observed.Results The number,size,weight of the hepatic metastatic lesions were obviously inhibited by As2O3 in early time and metaphase; the percentage of hepatic replacement by tumour was decreased and the survival period of tumorloading nude mice was prolonged compared with the control(P<0.05).Conclusion As2O3 can inhibit the live metastasis from human colon cancer in nude mice and early treatment could be more efficient than metaphase and later.
Key words:Nude mice; Colon cancer; Liver tumor;Secondary; As2O3
肝脏是结、直肠癌最常见的血行转移和术后复发部位[1]。结、直肠癌肝转移多发生于原发灶切除术后三年以内,且治疗困难,预后较差[2]。三氧化二砷(Arsenic Trioxide ,As2O3)已成功地应用于临床治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL),取得良好的效果[3]。但As2O3应用于结、直肠癌肝转移仍少见报道。本文研究As2O3在不同时相点对人结肠癌裸鼠肝转移的抑制作用,为临床上治疗结、直肠癌肝转移提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠腺癌LS174T细胞株购自中科院上海细胞所细胞库。BALB/Cnu/nu裸鼠32只(第三军医大学实验动物中心提供),4~6周龄,雌雄兼用,体重14~23g,在无致病菌(specific pathogen free SPF)条件下的层流架中饲养。亚砷酸注射液(每支10 ml,内含As2O310mg)由哈尔滨医科大学第一临床医院提供(批号:国药准字X19990191)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 LS174T细胞在CO2孵箱中培养,恒温37℃、5%CO2饱和湿度。RPMI1640培养液内含10%灭活小牛血清、100u/ml青霉素、50mg/ml链霉素。取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化,制备成单细胞悬液,台盼兰染色测定细胞活力≥95%,调节细胞浓度为1×107/ml备用。
1.2.2 模型制备 参照左国华等[4]方法进行。在超净工作台内按照无菌手术原则操作。1%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔内麻醉,左上腹纵行切口,进腹后游离脾脏并拉至切口外,用4号针穿刺脾组织,缓慢注入LS174T细胞悬液0.2ml(含细胞2×106个)。拔出针头后用95%酒精棉球压迫,轻揉3min后,切除脾脏,关腹。术后裸鼠继续在SPF条件下饲养。
1.2.3 实验分组 32只裸鼠随机分成4组,每组8只。早期治疗组(A组)、中期治疗组(B组)、晚期治疗组(C组)于接种癌细胞10min、10天、20天后由荷瘤鼠尾静脉注射As2O3 5mg/kg 0.2ml;生理盐水对照组(D组):于接种癌细胞10天后由荷瘤鼠尾静脉注射生理盐水0.2ml。给药均在超净工作台内进行,每日1次,连续给药至对照组出现死亡为止。
1.3 观察指标
1.3.1 大体观察 每天观察各组裸鼠活动及饮食情况,测量其体重的变化。
1.3.2 肝转移癌模型与As2O3对荷瘤鼠肝转移癌形成的影响 各组裸鼠分别于术后第四周剖腹探查,观察肝转移灶的生长情况后关腹,继续在SPF条件下饲养至死亡,即行详细解剖学检查,解剖分离肝脏、肺脏、心脏、肾脏等内脏器官,观察各脏器转移情况。计数各组裸鼠肝转移癌结节数目。
1.3.3 As2O3对荷瘤鼠肝转移癌结节大小及瘤重的影响 裸鼠死亡后,完整切下肝脏称重;然后仔细从肝组织中逐一分离癌结节,测量其直径大小(每个结节测量3次,取其平均值)并称重。计算各裸鼠肝脏的肿瘤替代率=癌结节重量总和/整个肝脏重量×100%。
1.3.4 荷瘤鼠生存期 逐日观察记录荷瘤鼠生存期,计算延命率=(治疗组存活天数-对照组存活天数)/对照组存活天数×100 %。
1.4 统计学方法
采用Microsoft excel 2000 软件中的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
在实验过程中,对照组裸鼠一般情况较差,静卧少动,反应呆滞,进食水减少,晚期腹部膨隆、肌体消瘦呈恶病质状。各组均未见明显毒副作用。各组裸鼠在剖腹探查和尸检中,心、肾、肺等主要脏器细胞均未见明显形态学改变。表明一定剂量的As2O3,不会对机体造成严重的毒副作用。
2.2 各组裸鼠体重的变化
裸鼠体重增加与其腹水产生及成瘤时间相对应。对照组在接种后10天开始出现体重增加,而后迅速上升;而早期治疗组于20天左右体重才开始缓慢增加,见图1。
2.3 肝转移癌模型与As2O3对荷瘤鼠肝转移癌形成的影响
所有裸鼠均有肝转移癌形成,成功率达100%。结果表明,As2O3对荷瘤鼠肝转移癌形成有抑制作用,尤其早期治疗组对肝转移癌形成的抑制作用最为明显,其次为中期治疗组,而晚期治疗组的抑制效果不明显,见表1。表1 As2O3对人结肠腺癌裸鼠肝脏转移癌数目的影响抑癌率=(1- 实验组肝转移灶平均数目/对照组肝转移灶平均数目)×100 %2.4 As2O3对荷瘤鼠肝转移癌结节大小、瘤重及肝脏肿瘤替代率的影响
结果显示,As2O3对荷瘤鼠肝转移癌结节大小及平均重量均有一定的抑制作用,早期治疗的抑制效果更为明显,见表2、3。
2.5 As2O3对荷瘤鼠生存期的影响
各组裸鼠均在SPF条件下喂养直至死亡,逐日观察记录荷瘤鼠生存期,见表4。提示早期治疗可显著延长荷瘤鼠的生存期,晚期治疗效果不佳。表2 As2O3对荷瘤鼠肝转移癌结节大小(直径,mm)的影响(±s,n=8) *:肝转移癌结节大小抑制率=(1-实验组肝转移癌结节平均直径/对照组肝转移癌结节平均直径)×100% ▲:P< 0.01;☆P>0.05 vs Control(D); ★:P< 0.01 vs Early(A);◇:P>0.05 vs Middle(B); ◆:P>0.01 vs Middle(B)表3 As2O3对荷瘤鼠肝转移癌 *:肝转移癌结节重量抑制率=(1-实验组肝转移癌结节平均重量/对照组肝转移癌结节平均重量)×100% ▲:P<0.01;☆:P>0.05 vs Control(D);★:P<0.01 vs Early(A);■:P<0.01 vs Middle(B)表4 As2O3对荷瘤鼠生存期的影响(±s,n=8)
3 讨论
A2O3是我国传统中药砒霜的主要成分,但砷化物长期以来被认为是一种致癌剂,能抑制细胞DNA和RNA合成、干扰细胞代谢、致细胞染色体畸形[5]。Douer等[3] 大样本统计As2O3注射液静滴治疗APL,完全缓解率高达87%,且无严重的骨髓抑制等毒副作用。其机制为诱导APL细胞株NB4细胞发生凋亡,抑制白血病细胞生长[6]。蔡洪培等[7]、张兴荣等[8]分别报道As2O3可以抑制结肠癌(Lovo细胞)和胃癌(MKN45细胞)裸鼠腹腔转移和腹水产生。本实验进一步以人结肠癌裸鼠肝转移模型为对象,探索As2O3的体内抗肿瘤作用。根据文献[9]小鼠的药物用量是临床人的用量的25~50倍(按单位体重计算),我们采用As2O3注射液临床治疗APL用量0.15 mg/(kg·d)[10]的33倍即5mg/(kg·d)作为使用剂量,并根据左国华等[4]方法设置早、中、晚期,观察As2O3不同时相点对人结肠癌裸鼠肝转移的抑制作用。
本实验结果显示,早期治疗对荷瘤鼠肝转移灶的数目、大小、瘤重和肝脏肿瘤替代率的抑制作用都明显优于晚期治疗组(P<0.01);生存期也明显长于晚期治疗组(P<0.01)。表明在临床上结、直肠癌根治术中即经门静脉灌注一定剂量的As2O3,可能会对癌细胞的肝转移或肝脏中的微转移灶起到一定的治疗作用,从而达到改善预后和延长生存期的目的。第四周时,中期治疗组肝转移灶与晚期相比差异无统计学意义(P>0.05);而在死亡时,其差异却有统计学意义(P<0.01)。提示较长时间用药有可能获得一定的疗效。马丹等[11]研究结果显示:与对照组相比,As2O3可明显延长荷瘤鼠的生存期,抑制肝转移;治疗组血清和腹水中CEA水平均低于对照组,转移癌细胞G0/G1期比例上升,S期比例下降。本实验可与上述实验一起共同提示As2O3有可能成为防治结肠癌肝转移的另一种选择,其具体机制及其临床应用的剂量尚待进一步的研究。
【参考文献】
[1] Weber SM,Jamagin WR,DeMatteo RP,et al.survival after resection of multiple hepatic colorectal metastases [J].Ann Surg Oncol,2000,7(9): 643 650.
[2] Asbun HJ,Hugher KS.Management of metastatic colorectal carcinoma [J].Surg Clin North Am,1993,73(1):145 166.
[3] Douer D,Tallman MS.Arsenic trioxide: new clinical experience with an old medication in hematologic malignancies[J].JClinOncol,2005, 23(10):23962410.
[4] 左国华,葛海燕.人源性结肠腺癌裸鼠肝转移模型的建立[J].中华实验外科杂志,1999,16(4):373.
[5] Dong JT,Luo XM.Effects of arsenic on DNA damage and repair in hunan fetal lung fribroblasts[J].Mutat Res,1994,315(1):1214.
[6] Baysan A,Yel L,Gollapudi S,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis via the mitochondrial pathway by upregulating the expression of Bax and Bim in human B cells[J].IntJOncol,2007, 30(2): 313318.
[7] 蔡洪培,邓志华,李石,等.三氧化二砷对裸鼠结肠癌腹腔转移的抑制作用[J].中华消化杂志,1999,19(6):378380.
[8] 张兴荣,蔡洪培,邓志华,等.三氧化二砷对人胃癌裸鼠腹腔种植腹水生成的影响[J].癌症,2001,20(5):477 479.
[9] 吴细丕,钱林法.实验动物与肿瘤研究[M].北京:中国医药科技出版社,2000.90.
[10]Novick SC,Warrell RP.Arsenicals in hematologic cancers[J].Semin Oncol,2000,27(5):495501.
[11]马丹,葛海燕.三氧化二砷对人结肠癌裸鼠肝转移的抑制作用[J].重庆医学,2003,32(2):145146.