RNA干扰及其在乳腺癌研究中的应用

　　作者：孙妍琳 周庚寅

　　【关键词】RNA干扰?乳腺肿瘤

　　RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)引起的，广泛存在于动植物中的序列特异性转录后基因沉默，从而抑制其相应基因表达的过程。作为高效、特异的调节基因表达的技术，RNAi已成为基因功能研究的有力工具。

　　1 RNAi的发现

　　1996年，Arizona大学的Rich Jorgensen等[1]设想将更多的色素基因导入矮脚牵牛花中以求得到色彩更艳丽的花朵，但意外的是转基因的牵牛花中不仅没有新基因的表达，而原色素基因表达也受到抑制而使花朵出现花斑或条纹状，他们把这种现象称为“共抑制现象”。

　　1998年卡耐基研究院Fire等[2]首次提出了“dsRNA介导的RNA干扰”现象。他们将靶向Par1基因的dsRNA注入秀丽新小杆线虫(C.elegans)虫卵中，发现dsRNA抑制靶基因表达的能力比任一单链RNA至少高2个数量级，靶mRNA受到明显的抑制且呈现出可传递给后代的特异表型。随后此技术在全球得到广泛开展和应用，并在其它生物如果蝇、真菌、小鼠胚胎细胞中相继证实。

　　2 RNAi的分子机理

　　RNAi现象最初被认为与内源性RNA降解有关。dsRNA能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA,而靶向基因的内含子或启动子则没有明显的抑制效应，表现出高度的序列特异性。Tush1等[3]发现果蝇胚胎提取物可能含有参与RNAi的成分，dsRNA在此提取物中孵育后能降低荧光素酶mRNA翻译形成荧光素酶的能力，提示靶mRNA降解可能与一种核酸酶有关，这种核酸酶是一种核糖核蛋白，称为RNA诱导的沉默复合物(RNAinduced silencing complex RISC)，已经从人工诱导的形成RNAi的果蝇细胞中分离。

　　目前研究认为，RNAi的分子机理分为两个阶段：①RNAi起始阶段：在RNAi的起始阶段，加入的dsRNA在一种具有RNaseⅢ样活性的dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA specific endonuclease,Dicer)作用下被切割成21~23nt的具有双链结构的小干扰RNA(siRNA)，这些siRNA具有5'磷酸、3'羟基末端以及2个游离nt突出，从而在RNAi调控途径中起着关键的作用[4]。②RNAi的效应阶段：在RNAi效应阶段，siRNA与RISC的无活性前体结合，在ATP作用下siRNA双链结构解旋并诱导形成有活性的RISC。有活性的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA，降解目的mRNA[5]。

　　3 RNAi的特点

　　①序列特异性：dsRNA能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA,无关序列的基因表达无干扰作用[6]。siRNA除正义链3'端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基改变就可能使RNAi作用减弱甚至失效[7]。②传递性：RNAi的效应可以在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持效应，并可以传递给子一代[8]。③高效性：RNAi以21nt siRNA为中间产物，在酶复合体作用下降解mRNA，这些酶复合体结合底物产生作用后又分离，与另一个底物结合，如此循环往复，高效率的降解mRNA。相对少量的siRNA就可以抑制基因表达[9]。④时间剂量依赖型：RNAi的效应强弱在一定范围内与dsRNA的剂量成正比，而与作用时间成反比。⑤高稳定性：siRNA分子是3'端有突出的非配对碱基的双链分子，在细胞内可稳定存在3~4d，半衰期长于反义寡核苷酸。

　　4 RNAi的合成

　　4.1 体外合成siRNA 体外合成siRNA包括化学合成siRNA和体外转录合成两种。根据siRNA的结构特点和生物学特性，设计合成siRNA应遵循如下原则①选择起始密码子后外显子编码区的序列;②寻找以AA开始的长21~23bp的序列，GC的含量通常在30%~55%之间，尽量避免3个同样的核苷酸连续出现;③选择的DNA片断进行BLAST分析，排除非特异性抑制其他人类基因的可能。按以上原则设计的siRNA特异性强，且能明显抑制目的基因的表达。化学合成siRNA：直接通过化学方法合成两条互补的长21~23nt的RNA单链，然后退火形成双链siRNA。这种方法成本大，花费高，作用持续时间短，限制了其进一步的应用。体外转录合成siRNA：通过合成两段29bp的DNA作为模板，分别在T3或T7启动子下体外转录合成两条互补的RNA单链，然后退火并经特殊核酸酶消化和传代产生21~23bp的双 链siRNA[10]。

　　4.2 体内合成siRNA 为克服体外合成RNA成本大、持续时间短的不足，许多学者利用含有RNA多聚酶Ⅲ(po1Ⅲ)启动子(H1 promoter)或U6启动子的载体来合成siRNA。一种方法是在表达载体独立的po1Ⅲ启动子后插入正义和反义的siRNA序列，转染细胞后根据其碱基互补的原理在体内构建siRNA双链;另一种是体外合成目的编码序列的反向重复序列，中间以4~9nt的碱基隔开，3'端有TTTTT结构的DNA片段，插入载体po1Ⅲ启动子或U6启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出短发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA)，shRNA在细胞内Dicer酶的作用下，形成双链siRNA[11]。这种方法通过siRNA表达载体可以更长时间的抑制目的基因表达，并可降低制备siRNA的成本。

　　5 RNAi技术在乳腺癌中的应用

　　5.1 乳腺癌的侵袭与转移 乳腺癌的侵袭和转移是乳腺癌患者主要的致死原因，而乳腺癌的发生是一个多阶段的过程，包含了许多基因的激活和失活。Fra1基因是fos家族成员和AP1转录因子组成部分，在高侵袭性的雌激素受体(ER)阳性的乳腺癌细胞系高表达，Belguise等[12]应用RNA干扰沉默Fra1基因在高侵袭性ERMDAMB231细胞的表达，可使乳腺癌细胞侵袭性显著下降，并可下调其他侵袭相关基因，从而证明Fra1基因表达水平与肿瘤侵袭性及肿瘤增殖等呈正相关。

　　CXCR4基因在高侵袭性的人乳腺癌细胞MDAMB231中高表达，Chen等[13]将构建的pU6I-CXCR4载体和对照的空载体稳定转染MDAMB231细胞，结果表明空载体对于乳腺癌细胞CXCR4的表达没有影响，而pU6ICXCR4载体明显下调CXCR4mRNA和蛋白水平的表达。体外侵袭力测定试验表明pU6ICXCR4载体作用后，MDAMB231细胞恶性侵袭力下降了14.5%左右，提示载体介导的RNAi技术可以用于乳腺癌的基因功能研究及实验治疗。

　　CXCR4基因不仅调节着乳腺癌细胞的侵袭，还与其转移密切相关。Smith等[14]使用载体介导的RNAi转入四期人乳腺癌的高度转移的裸鼠动物模型，特异性抑制了CXCR4基因表达。接种亲本细胞的裸鼠肿瘤发生自发性转移，并最终死亡，而所有接种靶向CXCR4基因的siRNA表达载体细胞的裸鼠肉眼观察无转移形成，且部分裸鼠无肿瘤形成。证明抑制CXCR4基因可以提高原发性和转移性乳腺癌病人的治疗效果。

　　Lipscomb等[15]在研究中介素α6β4是否能成为一个抑制肿瘤侵袭与转移的靶点时，体外化学合成siRNA转染乳腺癌MDAMB231细胞，特异性抑制中介素α6β4的亚基α6和β4基因，结果发现两种基因的表达降低并导致细胞表面中介素α6β4水平的降低，并且细胞的侵袭性与转移性均明显减弱。

　　5.2 RNAi用于抑制乳腺癌细胞耐药基因的表达 多药耐药(MDR)是临床上肿瘤化疗失败的主要原因，其中多药耐药基因1(MDR1)是产生耐药最主要的因素，MDR1在乳腺癌细胞内过度表达，使位于细胞膜上的P糖蛋白(PGlycoprotein,Pgp)表达增加。为有效逆转MDR，Wu等[16]使用化学合成的siRNA在乳腺癌具有MDR表型的MCF7/AdrR和MCF7/BC19细胞干扰MDR1的表达后，MDR1的mRNA和Pgp水平显著下降，细胞内紫杉醇和阿霉素积累较对照组显著增加，siRNA使MCF7/AdrR和MCF7/BC19细胞对长春花碱的耐药性降低了232倍和49倍。使MCF7/AdrR细胞对阿霉素和紫杉醇的耐药性降低了12倍和95倍。化疗药物作用12d后，siRNA转染的MCF7/AdrR和MCF7/BC19细胞对长春花碱的半数细胞抑制浓度分别下降至(1.26±0.40)nm、(0.14±0.05)nm(P0.01)，对阿霉素和紫杉醇的半数细胞抑制浓度亦有明显下降(P0.05)。实验结果肯定了特异性siRNA能够有效抑制MDR1编码的Pgp，提示siRNA为有效逆转多药耐药提供了新的途径。

　　5.3 乳腺癌的细胞周期调控 乳腺癌的发生中通常有细胞周期调控因子的突变，揭示细胞周期的稳定性与肿瘤的发生发展有密切关系。在含有野生型p53基因的MCF7乳腺癌细胞内细胞周期素G(cyclinG)的表达引起p53蛋白在DNA损伤后表达下降，并且消除了放射损伤引起的G1期阻滞与S期延长，Ohtsuka等[17]研究显示，通过RNAi沉默cyclinG的表达后，p53基因表达水平在DNA损伤后显著增加，提示p53转录激活cyclinG,而cyclinG反过来又负性调节p53基因的表达。Lu等[18]研究发现通过RNA干扰沉默细胞周期素D3(cyclin D3)阻滞细胞由G1期进入S期，可以下调抗凋亡因子Survivin的表达，使乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性增加。提示cyclinD3对肿瘤治疗有重要作用。

　　5.4 乳腺癌的治疗 RNAi能够高效、特异和快速的抑制基因表达，因而在肿瘤基因治疗方面显示出广阔的应用前景。RNAi技术通过调节细胞增殖和凋亡之间的平衡，对乳腺癌细胞的生长产生深远的影响。

　　SpankuchSchmitt等[19]采用化学合成的siRNA转染MCF7乳腺癌细胞发现PLK1mRNA水平下降70%，PLK1蛋白水平下降95%，转染48h后，细胞增长率降低66%~99%，细胞凋亡从1%~5%增至13%~50%。结果证实siRNA以很小的剂量便可以达到抑制肿瘤生长的效果。

　　Li等[20]转染针对Survivin基因的siRNA表达质粒进入MCF7乳腺癌细胞株，Survivin基因mRNA和蛋白表达水平明显降低，细胞凋亡增加，并显著抑制了MCF7细胞的增殖。针对Survivin mRNA设计的siRNA可通过诱导细胞凋亡增加而发挥抑瘤效果。

　　Wang等[21]则采用RNAi技术封闭抗凋亡因子cmyc的表达，结果显示RNAi可以显著抑制cmyc基因的表达，增加MCF7细胞的凋亡水平，并明显抑制体内外肿瘤细胞的生长，提示针对cmyc基因的RNAi在肿瘤基因治疗中的应用潜力。

　　Holle等[22]利用靶向Bcl2的siRNA表达载体转染MCF7细胞，结果显示在转染后MCF7细胞Bcl2 mRNA和蛋白表达下降，细胞凋亡率明显升高，细胞增殖减慢，提示RNAi可为乳腺癌的治疗提供一条新的途径。

　　6 展 望

　　RNAi技术已经日渐成为乳腺癌基因治疗中令人关注的研究热点。RNAi用于乳腺癌研究的相关报道表明，RNAi技术可以高效、特异的抑制多种与乳腺癌发生发展和耐药相关的基因表达，从而为乳腺癌的有效治疗开辟了新的途径。虽然RNAi的应用还存在安全性、靶向性等方面的问题，但随着对RNAi的深入了解及RNAi技术的不断成熟和完善，其在乳腺癌和其他人类疾病的基因治疗方面将存在着巨大的应用价值，为抗肿瘤基因治疗带来新的希望。

　　参 考 文 献

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　　孙妍琳，等.RNA干扰及其在乳腺癌研究中的应用

　　[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30300124)，山东省科技厅重点支持项目(022130112)

　　山东大学齐鲁医院 病理科 (山东 济南 250012)