siRNA抑制胃腺癌VEGFC表达和淋巴管生成

　　作者：邢春根，陈正荣，蒋银芬，吕孝东，吴永友，赵 奎 作者单位：215007 苏州大学附属第二医院普外科

　　【摘要】 目的 研究瘤内注射VEGFC siRNA抑制胃癌移植瘤VEGFC表达和肿瘤淋巴管生成的有效性。方法 建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型随机分为4组：VEGFC siRNA脂质体混合液组、单脂质体组、单siRNA组和PBS组，对肿瘤进行原位注射干预，记录各实验组肿瘤体积变化，免疫组织化学法检测各实验组肿瘤组织VEGFC的表达，并通过抗人CD31和抗人LYVE1单克隆抗体检测瘤体内血管和淋巴管生成情况。结果 免疫组化显示干扰组肿瘤细胞VEGFC染色减弱，和对照组相比VEGFC表达下调68.3%(P<0.01)，而胃癌组织中淋巴管密度(LVD)值干预组和对照组分别为3.2±1.3、9.8±2.7，VEGFC siRNA干预组LVD值下降至对照组的32.7%(P<0.01)，而MVD值无明显差异(P>0.05)。结论 瘤内注射VEGFC siRNA能显著下调肿瘤组织内VEGFC的表达，有效抑制肿瘤生长和瘤内淋巴管生成，而对肿瘤血管生成无影响。

　　【关键词】 胃腺癌;RNA干扰;血管内皮细胞生长因子-C;淋巴生成

　　Inhibition of Gastric Carcinoma Lymphangiogenesis with Small Interfering RNA Against VEGFC

　　XING Chungen,CHEN Zhengrong,JIANG Yinfen,LV Xiaodong,WU Yongyou,ZHAO Kui

　　Department of General Surgery,The Second Affiliated Hospital,Soochow University,Suzhou 215004,China

　　Corresponding Author: CHEN Zhengrong,Email: Zhengrong_ chen@sina.comAbstract：Objective To evaluate the inhibitory effects of VEGFC siRNA on VEGFC expression and tumor lymphangiogenesis in nude mice SGC7901 subcutaneous xenograft tumor models.Methods The nude mice model was divided randomly into 4 groups(n=6): VEGFC siRNAliposomesuspension,liposome only,siRNA only,and PBS injection.After injection intratumorally of every group the accumulation of tumor volume of each group was obtained.The expression of VEGFC in tumor tissue was measured by Immunohistochemistry (IHC).And the status of Angiogenesis and Lymphangiogenesis were examined by IHC staining with antiCD31 monoclonal antibody and antiLYVE1 monoclonal antibody.Results The expression of VEGFC in the VEGFC siRNA group was down regulated to 68.3%(P<0.01) compared with control group.The LVD value of interference group and control group was 3.2±1.3 and 9.8±2.7 respectively,reduced to 32.7%(P<0.01) of that in control group.But there is no obviously variance in MVD value between interference group and control group(P>0.05).Conclusion The VEGFC siRNA can dramatically down regulated expression of VEGFC in tumor tissue.And it lead to inhibition of tumor growth and tumor Lymphangiogeneis,but no effect on angiogenesis.

　　Key words：Gastric neoplasm;RNA interference; VEGFC;Lymphangiogenesis

　　淋巴结转移是胃癌预后不良的重要因素。研究显示甲状腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和胃癌等组织中VEGFC的表达水平与淋巴结转移率显著相关[14]。本研究拟通过siRNA技术抑制胃癌细胞中VEGFC表达和肿瘤淋巴管生成。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　中分化人胃腺癌株SGC7901为本实验室保存，胎牛血清购自杭州四季青公司，L型谷氨酰胺购自上海华为公司，DMEM购自美国 Gibco/brl公司。6～8周龄雌性BALB/c裸鼠购于上海动物研究所，动物饲养于SPF设施中，由苏州大学医学院动物实验室提供。转染试剂阳离子脂质体RNAiMate购自上海genepharma公司，抗VEGFC单抗购自武汉博士德公司，抗LYVE1单抗购自美国RnDSystem公司，抗CD31单抗、SABC试剂盒购自美国Zymed公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 胃癌细胞培养

　　SGC7901细胞以单层黏附进行培养和扩增，培养基为添加5%胎牛血清、2mol/L L型谷氨酰胺、庆大霉素的DMEM。细胞培养于37℃、5%CO2的环境中。

　　1.2.2 siRNA的制备

　　干扰VEGFC表达的siRNA由上海吉玛公司合成，正义和反义序列如下：VEGFC，5′TTACAGTGCCTCTCTCACAAG3′dTdT(正义链);5′CTTGTGAGAGAGGCACTGTAA3′dTdT(反义链)。siRNA冻干粉使用去核酶的双蒸水重新溶解制备成20μM的母液。

　　1.2.3 SGC7901裸鼠皮下移植瘤模型建立

　　收集SGC7901细胞,用0.25%的胰酶消化，使用含10%胎牛血清的培养基终止消化过程，PBS洗涤细胞1次，并将细胞重悬于PBS用于注射。活力大于90%的单细胞悬液用于裸鼠皮下注射，1×107个细胞悬于0.2ml PBS于BALB/c裸鼠(每组6只)背部皮下注射。肿瘤使用卡尺每5天测量一次。肿瘤体积使用下述公式计算：体积=W2×L/2(L为肿瘤最大长径，W为肿瘤短径)。

　　1.2.4 实验分组干预

　　大约一周后肿瘤直径达0.5cm(体积约50～60mm3)左右，即开始进行实验干预。实验分组：脂质体包埋的VEGFC siRNA进行瘤内注射，注射液为100μl，由转染试剂RNAimate 10μl混合50μl的siRNA母液(浓度20μM)混悬于40μl PBS中(注射液siRNA的浓度为10μM，其总量为13.4μg);单用VEGFC siRNA进行瘤内注射，注射液为50μl的siRNA母液混合50μl PBS;单用脂质体注射液为:RNAimate 10μl混合90μl PBS混合;单用PBS瘤内注射作为阴性对照。每种注射液在第一次注射后每7天瘤内注射1次，共注射3次。

　　1.2.5 免疫组织化学检测标本VEGFC、LYVE1及CD31表达

　　各实验组于实验干预后4周处死裸鼠取出肿瘤，免疫组化染色过程参考文献[5]。抗VEGFC(1∶100稀释)、抗LYVE1(1∶400稀释)或抗CD31(1∶400稀释)一抗分别检测各实验组肿瘤VEGFC、LYVE1及CD31表达情况。每张切片观察10个具有代表性的高倍镜视野，细胞质中有棕黄色颗粒沉着判为阳性细胞。按染色强度(SI)和阳性细胞百分率(PP)的乘积计算免疫反应评分(immunoreactive score，IRS)，即IRS= SI×PP。评分标准参考文献[6]。

　　1.2.6 微血管和微淋巴管密度评分

　　对VEGFC siRNA干预组和对照组切片分别进行微血管密度和淋巴管密度评分，先在40倍显微镜下观察整张切片的血管或淋巴管分布情况，然后选择癌灶内棕黄颗粒最密集的3个区域，即“热点”，再在200倍镜下计数每个区域中的CD31阳性和LYVE1阳性细胞，取5个区域的平均值作为该张肿瘤切片的MVD或LVD。染成棕色的血管(淋巴管)内皮细胞或血管(淋巴管)内皮细胞簇，只要它们和临近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就视为一个微血管或微淋巴管。

　　2 结果

　　2.1 VEGFC siRNA对肿瘤的生长抑制作用

　　SGC7901细胞裸鼠背部皮下注射，大约一周后，在注射部位可形成可见的皮下瘤，此时肿瘤体积约60mm3，给药干预。如VEGF-C siRNA no.1和对照组相比能够显著抑制肿瘤生长(P<0.001)，见图1。在治疗过程中，无明显的副作用。肿瘤接种后第10天、20天和30天时VEGFC siRNAs干预组(siRNA浓度为10μM)和PBS对照组裸鼠肿瘤的生长情况，见图2。

　　2.2 VEGFC siRNA瘤内注射干扰肿瘤VEGFC表达

　　肿瘤标本使用抗人VEGFC单抗免疫组化检测瘤体VEGFC表达，如图3所示，VEGFC表达主要定位于肿瘤细胞胞浆，血管或淋巴管的内皮细胞，肿瘤细胞中表现为弥漫的肿瘤细胞胞浆染色。

　　其中图3a、3b染色比图3c、3d有更多的胞浆染色，计算各组切片IRS分值，VEGFC siRNA干扰组为4.3±1.1;注射PBS对照组为13.6±2.8。经统计，VEGFC siRNA干扰组VEGFC表达和对照组相比下调了68.3%(P<0.01)。

　　2.3 VEGFC siRNA对肿瘤MVD和LVD的影响

　　染色结果见图4。LVD和MVD的定量结果见表1。结果显示：VEGFC siRNA处理组淋巴管密度明显降低，而单用PBS的对照组淋巴管密度明显增加。但VEGFC siRNA处理组和单用PBS对照组之间肿瘤的血管生成无明显差异。该结果显示：在肿瘤中使用VEGFC siRNA介导的基因沉默能有效抑制肿瘤淋巴管生成，而对肿瘤微血管生成无显著影响。

　　3 讨论

　　研究表明VEGF家族是血管内皮细胞特异性的唯一的生长因子，它包括：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和PLGF。其中VEGFC被认为是淋巴管生长因子，它能诱导淋巴管内皮细胞的增殖，通过内皮细胞膜上的VEGFR3或VEGFR2激活淋巴管内皮细胞和淋巴管的生长[7]。Oh等[8]报道VEGFC能诱导鸡胚绒毛膜囊淋巴内皮细胞的增殖和新生淋巴管形成，并认为淋巴管形成的起始信号途径是由VEGFC通过激活其受体VEGFR3所完成的。因此，VEGFC可能是肿瘤转移的发生和发展的关键因素，同时也是抑制肿瘤转移的潜在治疗靶点。我们使用有效的针对VEGFC的小干扰RNA对胃腺癌细胞实施基因沉默，以探讨其在胃癌动物模型体内抑制VEGFC表达的有效性和生物学效应。结果显示VEGFC siRNA干预组组织标本VEGFC表达明显减少。而在抑制裸鼠SGC7901皮下瘤组织中VEGFC表达后，肿瘤生长也明显减慢，由于VEGFC siRNA对胃腺癌细胞不存在凋亡诱导作用，故肿瘤生长受抑可能与其他因素相关。VEGFC能刺激肿瘤内淋巴管的生成，而淋巴管能进行一些生长因子及趋化因子的运输，从而完成瘤内肿瘤细胞之间的交互信号传导，使细胞进入增殖周期[9]。VEGFC siRNA使VEGFC表达受抑从而干扰了瘤内淋巴管的生成，并使瘤内细胞间VEGFC信号通路受阻，最终阻止了细胞的增殖。

　　有文献[5，1012]认为：VEGFC和VEGFD与肿瘤中的淋巴生成相关，侵入周边淋巴生长使肿瘤细胞进入淋巴系统的可能性大大增加，淋巴的密度与肿瘤转移的淋巴结数量关系密切。Padera等[8]研究发现在肿瘤间质中发现淋巴管密度的增加，而肿瘤周边的间隙可能是肿瘤细胞进入淋巴系统的重要部位，所以侵犯性肿瘤中淋巴管的生长使肿瘤细胞进入淋巴系统成为可能，而如果肿瘤能分泌VEGFC和VEGFD便能刺激局部淋巴的生成，从而增加肿瘤细胞进入淋巴系统的可能。研究显示VEGFC和VEGFD的表达与局部淋巴转移显著相关，阻断内源性的VEGFC和VEGFD的表达能在体内抑制转移灶的形成[10]。在He等[9]研究中显示：肿瘤细胞分泌的VEGFC能够诱导外周淋巴管向肿瘤细胞萌芽，且使肿瘤淋巴管膨胀，在异种移植肿瘤模型中在肿瘤接种后的2～3周淋巴密度显著增加，肿瘤转移也同时发生在该期;同时通过系统注射编码VEGFR3的可溶性抗体的腺病毒，转录后表达可溶性抗VEGFR3抗体阻断VEGFR3与其配体VEGFC的结合，从而抑制这个时期内的淋巴生成;研究结果还显示：当肿瘤细胞已进入淋巴系统后，VEGFR3抗体并不能抑制肿瘤转移，这就意味着在肿瘤转移过程中肿瘤细胞进入淋巴系统是关键的一步[11]。在胃癌肿瘤组织的间质中可以发现存在着新生并发生扩张的淋巴管，侵入淋巴管管内的肿瘤细胞被认为是肿瘤的淋巴侵润，在Yutaka等[5]的试验中，VEGFC的表达与淋巴侵润和淋巴结转移密切相关，在VEGF-C高表达的肿瘤中出现远处淋巴结转移的比例显著高于低表达VEGF-C的肿瘤。Makoto等[12]对VEGFC和VEGFD与早期胃癌淋巴转移的相关性作了细致研究，发现VEGFC的表达和早期胃癌的淋巴转移有显著的相关性，同时结果显示：VEGFC在分化型胃腺癌中高表达，而在未分化腺癌中则为阴性表达。

　　本实验结果显示，在人胃癌细胞中siRNA介导的VEGFC基因沉默能够抑制肿瘤内淋巴管生成，与文献结论相似。LYVE1是标记肿瘤组织中淋巴管的特异性抗原，通过抗体进行免疫组织化学染色，以显示肿瘤组织中的淋巴管，从而较清楚地表现了使用VEGFC siRNA干预后，肿瘤中淋巴管数量的变化。本研究结合LVD的检测，可以清楚地看出在使用VEGFC siRNA干预SGC7901皮下肿瘤后，肿瘤组织内的淋巴管密度显著降低，表明：肿瘤内注射VEGFC siRNA是抑制体内肿瘤淋巴管生成的有效方法。本实验采用抗CD31染色计算微血管密度，显示VEGFC siRNA干扰VEGFC表达的特异性，他不能干扰VEGFA、B的表达，因而对肿瘤的血管生成并无影响。

　　He等[13]使用受体单抗融合蛋白(VEGFRIg 融合蛋白)能同时结合VEGFC和VEGFD，理论上对淋巴管生成抑制的效果更好，但VEGFR3Ig不能使已发生淋巴转移的肿瘤细胞失去转移特性，当淋巴生成和转移受到抑制时，肿瘤细胞仍能进入淋巴结，故认为影响肿瘤转移的另一重要因素是肿瘤细胞本身具有的侵润特性。而 Lin等[14]则认为VEGFC和VEGFR3在前列腺癌和黑色素瘤的区域淋巴转移中占主导地位，故他们通过腺病毒重组体表达可溶的VEGFR3Fc来抑制肿瘤源性的VEGFC，在肿瘤接种模型中注射重组腺病毒，起到了明显的抑制肿瘤淋巴生成和肿瘤转移的效果。然而，使用单克隆抗体作为治疗手段，因其存有免疫原性和缺乏较高的特异性，与VEGFC RNA干扰相比还是略显不足。本实验使用VEGFC siRNA干扰不仅显著抑制了VEGFC表达，而且对肿瘤微血管密度不产生影响，彰显了该技术高度的特异性。

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