三氧化二砷抑制肝癌HepG2细胞侵袭转移 及对RhoC基因表达的影响

　　作者：冯觉平,黄涛,王亚萍,方静,李敏,孔庆志 作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属普爱医院(武汉市普爱医院)肿瘤科

　　【摘要】 目的 了解三氧化二砷(As2O3)对肝癌HepG2细胞体外黏附、侵袭和迁移的抑制作用及对转移基因RhoC表达的影响，探讨As2O3抑制肝癌细胞转移的机制。方法 分别采用MTT法、Transwell检测As2O3对HepG2细胞黏附、迁移、侵袭能力的影响; 采用RTPCR、Western blot 方法检测As2O3作用前后HepG2细胞中RhoC基因的表达及变化。结果 As2O3作用后HepG2细胞黏附率、侵袭及侵袭细胞数较对照组明显下降(P<0.05)。As2O3作用4、6、8天后RhoCmRNA及蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05)。HepG2细胞中RhoCmRNA表达和蛋白表达具有相关性 (r=0.92,P=0.046)。结论 As2O3可明显抑制HepG2细胞细胞黏附、迁移和侵袭的能力;并可通过下调RhoC基因的表达而抑制其侵袭转移。

　　【关键词】 三氧化二砷;肝癌细胞;HepG2细胞;转移;RhoC基因;表达

　　Effect of Arsenic Trioxide on Invasion and Metastasis and RhoC Gene Expression of Human Hepatocarcinoma Cells in Vitro

　　FENG Jueping,HUANG Tao,WANG Yaping,FANG Jing,LI Min ,KONG Qingzhi

　　Department of Oncology,The Puai Hospital ,Tongji Medical college,Huazhong University of Science and Technology, WuHan 430030,China.

　　Corresponding Author:HUANG Tao,Email:fengjueping@163.comAbstract：Objective To evaluate the effects of the arsenic trioxide(As2O3) on antagonizing invasion and metastasis and to investigate the effect of As2O3 on RhoC gene expression in Human Hepatocarcinoma cell line HepG2.Methods Adherence ability,Migration and invasion of HepG2 cell inhibited by As2O3 were assessed by MTT and transwell technique. Expression levels of RhoCmRNA and protein in HepG2 cell were determined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction( RTPCR) and Western blot ,respectively.Results The number of adhesion,migration and invasion of HepG2 cells were significantly lower in As2O3 Group than in the control group(P<0.05). A significant down-regulation of expression of RhoC gene mRNA and protein levels were observed in HepG2 cells when 0.25mg/L As2O3 was given after 4,6 and 8 days(P<0.05).Relations between mRNA and protein expression level of RhoC gene in HepG2 were found close (r A =0.92,P=0.046).Conclusion The adherence,migration and invasion ability of HepG2 cell is markedly inhibited by As2O3 . As2O3 is able to inhibit the invasion and metastasis of HepG2 cells by downregulation of RhoC gene expression.

　　Key words：Arsenic Trioxide;HepG2 cells;Metastasis;RhoC gene;Expression

　　在肿瘤的侵袭和转移过程中有大量的分子介入，其中一些关键的因子和机制还有待证实[1]。已有研究证实,RhoC基因的表达水平与癌细胞的侵袭潜能密切相关[2]，且As2O3有一定的抗肝癌细胞黏附和侵袭作用[3],但As2O3抗肝癌侵袭转移的机制尚不十分明了。本研究观察了As2O3对HepG2细胞体外侵袭、迁移的抑制作用及对转移基因RhoC表达的影响，旨在探讨As2O3抑制肿瘤转移的分子机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人肝癌细胞株HepG2由华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科实验室惠赠;0.1%As2O3(10mg/支)为哈尔滨伊达药业有限公司产品;带有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell细胞培养小室、Matrigel胶和羊抗人RboC多克隆抗体分别购于美国Costar、BD和Santa Cruz公司。自动酶标读数仪，BioRad550型，波长492nm，美国。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养，以0.25%胰蛋白酶常规消化，按所需浓度接种[4]。

　　1.2.2 MTT法检测As2O3对HepG2细胞黏附能力的影响 取对数生长期HepG2细胞配成浓度为1×105/ml的细胞悬液,常规培养。参照文献[5]以MTT法测定细胞黏附能力。实验组为0.25mg/L As2O3，对照组为含10%胎牛血清的DMEM。各组细胞分别在30、60、90、120min时吸出悬浮的、未黏附的细胞，测定每孔OD值。细胞黏附率=(处理组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。黏附抑制率=[1-(处理组平均OD值/对照组平均OD值)]×100%。

　　1.2.3 Transwell检测As2O3对HepG2细胞迁移、侵袭能力的影响 Transwell小室杯底由8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜封闭。体外侵袭能力的测定时侵袭小室的滤膜不用Matrigel覆盖。实验参照文献[5]改良。下室加入0.5ml含20%血清培养，上室加入细胞悬液(2×106/ml，200μl/每孔),各设3个复孔。实验组为0.25mg/L As2O3，对照组为含10%胎牛血清的DMEM。各组常规培养、孵育、4%多聚甲醛固定、苏木精染色，镜下随机计数5个视野的穿膜细胞平均数(400×)。侵袭抑制率=(1-As2O3组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100%

　　1.2.4 RTPCR方法检测HepG2细胞中RhoCmRNA的表达 收集0.25mg/L As2O3作用4d、6d、8d后的细胞分别提取总RNA,行RTPCR反应。参照文献[6]设计引物，RhoC和内参照βactin分别为183、587bp产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统分析电泳条带灰度值。RhoC mRNA 表达相对强度= RhoC条带灰度值/βactin条带灰度值。

　　1.2.5 Western blot检测HepG2细胞中RhoC蛋白的表达 取上述培养细胞常规细胞裂解、蛋白变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白电泳、转膜。PVDF膜先后置于1∶500稀释的一抗稀释液中37℃孵育1h，1∶1000稀释的二抗稀释液中孵育，PBST洗膜后加入DAB显色。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计软件，细胞生长抑制率用F检验,计量资料的组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 As2O3对HepG2细胞黏附的影响

　　As2O3对HepG2细胞黏附力的影响，见表1。实验组各时段的细胞黏附率均明显低于对照组(P<0.05)，各时段黏附抑制率分别为33.6%、23.7%、22.5%和20.0%，各时间段之间差异无统计学意义(P>0.05)。表1 MTT法检测As2O3对HepG2细胞黏附率的影响

　　2.2 As2O3对HepG2细胞迁移、侵袭的影响

　　As2O3组迁移细胞数及侵袭细胞数均明显低于对照组,迁移抑制率和侵袭抑制率分别为55.19%和58.21%，见表2。对照组细胞轮廓清晰，活力旺盛，As2O3组细胞明显变圆，稀疏。表2 As2O3对HepG2细胞迁移力和侵袭力的影响

　　2.3 As2O3对肝癌HepG2细胞中RhoC基因表达的影响

　　As2O3作用前RhoC mRNA表达量为(1.40±0.44)，0.25mg/L的As2O3作用4d、6d、8d后，RhoCmRNA表达量分别降为(0.66±0.21)、(0.50±0.19)和(0.38±0.13)，各时间段表达水平均明显低于药物作用前(P<0.05);此外，As2O3作用前及作用后4、6、8d,RhoC蛋白量分别为(2.40±0.22)、(1.64±0.31)、(1.54±0.29)和(0.74±0.17)，各时段与用药前RhoC蛋白表达比较差异也有统计学意义(F=13.7，P=0.033)，见图1、2。

　　2.4 HepG2细胞中RhoC基因mRNA和蛋白表达的相关性分析

　　使用双变量相关分析统计RhoC基因mRNA和蛋白表达之间的关系发现，HepG2细胞中RhoC基因mRNA的表达和蛋白含量存在正相关

　　3 讨论

　　肿瘤的侵袭及转移是较为复杂的动态过程，是疾病进展的主要原因。Liotta[7]曾最早提出了侵袭转移过程的“三步”假说：黏附、降解与移动。本研究在对肝癌细胞系HepG2细胞的研究中发现，HepG2细胞黏附率在120min时高达91.30%，迁移和侵袭细胞数分别为(221.67±7.37和(156.34±13.50)。提示HepG2细胞具有较强的黏附能力和较强的侵袭和转移能力，表明本株肝癌细胞株具有转移倾向。As2O3可使其黏附抑制率明显下降，且随着时间的延长，黏附能力无恢复迹象。同时As2O3可使迁移细胞数及侵袭细胞数分别下降为(99.33±3.51)和(65.33±6.66)，其抑制率分别为55.19%和58.21%，并可使细胞形态发生明显的改变。提示As2O3可降低肝癌HepG2细胞异质黏附能力，阻止侵袭转移的发生，且抑制作用具有不可逆性。此外，As2O3能通过穿过聚碳酸脂膜的肝癌细胞数量减少，降低肝癌细胞的侵袭和运动能力。因此，As2O3除诱导肝癌细胞凋亡、抑制增殖、抗肿瘤血管形成作用外，还具有抑制肝癌细胞转移的作用。

　　肿瘤细胞的侵袭和转移能力是恶性肿瘤最基本的特性，肝癌细胞的黏附和侵袭是肝癌发生转移的重要步骤，抑制肝癌细胞的侵袭可能降低肝癌转移的发生。本研究结果提示As2O3可能是很有前途的抑制肿瘤转移复发的药物。这为As2O3在临床上用于肝癌的治疗提供了新的思路。

　　现已明了，RhoC是小分子G蛋白超家族中Rho亚族的蛋白之一。近年来，诸多研究结果表明[6,8]，RhoC基因的表达水平与癌细胞的侵袭潜能相关。Rho相关的细胞内信号决定着恶性肿瘤的转移潜能[6,9]。我们在本研究中观察到As2O3作用后RhoCmRNA表达水平及蛋白水平均有不同程度的下降，其下降呈时间依赖，且As2O3对RhoC基因的调节作用在RhoC基因mRNA和蛋白水平上有一致性，下调RhoC表达的同时伴随着肝癌细胞迁移、侵袭的抑制。该结果提示As2O3对高表达的RhoC基因均有不同程度的下调作用，下调RhoC的表达可明显抑制肝癌细胞的迁移与侵袭。

　　已知As2O3是一种细胞毒药物，我们的前期研究中观察到，As2O3能抑制细胞增殖、诱导凋亡、逆转耐药[10]。本实验中我们进一步观察到，As2O3还具有抑制侵袭转移的作用，且其抑制侵袭转移的作用与下调RhoC基因的表达有关。因此，As2O3的抗肿瘤作用可能是多途径的，针对RhoC基因的靶向治疗可能是肝癌治疗的新思路。

　　【参考文献】

　　[1] Liotta LA Steeg PS,StetlerStevenson WG.Cancer metastasis and angiogenesis:an imbalance of positive and negative regulation[J].Cell,1991,64(2):327336.

　　[2] Van Golen KL,Wu ZF,Qiao XT,et al. RhoC GTPase,a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype[J].Cancer Res,2000,60(20): 58325838.

　　[3] 华海清,秦叔逵,王锦鸿,等.三氧化二砷对人肝癌细胞黏附和侵袭影响的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2004，24(10):922925.

　　[4] 冯觉平,孔庆志,黄涛,等.三氧化二砷抑制肝癌细胞侵袭转移的实验研究[J].临床外科杂志,2008,16(7):448450.

　　[5]Yao Z,Che XC,Lu R,et al.Inhibition by Tyroserleutide (YSL) on the Invasion and Adhesion of the Mouse Melanoma Cell [J].Mol Med,2007,13(12):1421.

　　[6] Shikada Y,Yoshino I,Okamoto T,et al.Higher Expression of RhoC Is Related to Invasiveness in NonSmall Cell Lung Carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(14):52825286.

　　[7] Liotta LA.Tumor invasion and metastasis role of the extracelluar matrix： Rhoads Memorial Award lecture[J].Cancer Res,1986，46(1)：l7.

　　[8] Clark EA，Golub TR，Lander ES，et a1.Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for Rhoc[J].Nature,2000，406(6795)：532535.

　　[9] Ruth MC,Xu Y,Maxwell IH,et al.RhoC promotes human melanoma invasion in a PI3K/Aktdependent pathway[J].J Invest Dermatol,2006 ,126(4):862868.

　　[10]冯觉平,孔庆志,黄涛,等.三氧化二砷对肺腺癌耐药细胞A549/R耐药性的影响[J].中华实验外科杂志，2006，23(2)，201203.