血管生成抑制因子arresten的真核表达体系的建立

　　作者：龙淼云 作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科

　　【摘要】 目的 构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系。方法 用脂质体转染法，通过真核表达载体pSecTag2arresten 将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin 筛选获得阳性细胞克隆，逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测arresten mRNA表达， 免疫蛋白印迹技术(Westernblot)测arresten蛋白的表达。结果 经过筛选获得阳性克隆的CHO细胞，RTPCR、Westernblot结果提示arresten基因成功导入CHO细胞并进行表达。结论 获得了稳定表达人arresten因子的CHO细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用机制奠定了良好的基础。

　　【关键词】 arresten 真核表达 CHO

　　arresten是Colorado等[1]发现的一种强效的血管生成抑制因子，它属于Ⅳ型胶原α1链的羧基末端NC1结构域多肽片段，其分子量为26ku，它能够通过抑制血管生成进而抑制裸鼠移植瘤的生长。但有关arresten因子的分子结构特点及其抑制肿瘤血管生成的具体途径和作用机制目前知之甚少。我们采用脂质体转染的方法将arresten基因的表达质粒导入体外培养的中国仓鼠卵巢CHO细胞株中，经过筛选，并鉴定其表达,在国内首先获得了arresten真核表达细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用途径和具体机制奠定了良好的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 质粒、细胞 真核表达质粒pSecTag2 arresten本课题组构建(另文发表)，中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)由华中科技大学同济医学院中心实验室提供。

　　1.1.2 主要试剂 F12培养基、新生牛血清、Trizol为Gibco产品，一步法RTPCR试剂盒购自大连宝生物有限公司，引物由上海生工科技公司合成，PCR marker为天为时代产品。脂质体Lipofectamine 2000、抗生素Zeocin 购自Invitrogen公司，抗人arresten抗体及二抗 HRP标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物科技公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达质粒pSecTag2arresten转染CHO细胞 用阳离子脂质体Lipofectamine 2000 介导转染CHO细胞。根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组：pSecTag2arresten转染组;转染空载体pSecTag2的阴性对照组;未转染的CHO细胞空白对照组，转染方法按照Lipofectamine 2000说明书进行操作。简单过程如下：转染前2 d以胰酶消化CHO细胞，接种24孔板，每孔计数细胞在(1～3)×105个，以含血清无抗生素的F12培养基培养，细胞为90%的面积时用于转染，以1μg pSecTag2arresten溶于50μl培养基，2μl Lipofectamine 2000溶于50μl培养基，孵育5 min后混合20 min，缓慢滴入含有500μl OPTIDMEM无血清培养基的CHO细胞中，6h后将培养液换为含血清的F12培养基培养。

　　1.2.2 阳性克隆的筛选 转染后的第24h，将培养板中的细胞按1∶10比例分散培养，转染后的第48h开始加抗生素Zeocin进行筛选，筛选浓度为130μg/ml，出现阳性克隆后，100μg/ml维持筛选约15d。

　　1.2.3 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测转染的arresten基因的mRNA表达 根据已知的arresten基因序列，使用Primer5引物设计软件设计引物,引物由上海生工工程有限公司成。上游引物序列P1为：GTCAGGATCCTCTGTTGATCACGGCTTC，下游引物序列P2为GGGCAAGCTTTGTTCTTCTCATACAGAC;内参照物βactin上游引物序列βactin1为CTCCGCAGGGTGTGATGGTG;下游引物序列βactin2为AGAAGGGCGTGCTGAGAAGTTGA。arresten、Bactin的扩增片断分别为711bp和307bp。采用一步法行RTPCR，反应体系：Rnase Free H2O 19μl,5χ Reaction Buffer 10μl,2.5mM dNTPs 6μl,25mM Mn(Oac)2μl,P1 2μl,P2 2μl,βactin1 2μl,βactin2 2μl,10u/μl Rnase 抑制剂2μl,2.5 u/μl rTth DNA polymerase 2μl, 总RNA 2μl。反应条件：60℃,30min;94℃,2min;94℃,10min，60℃,1.5min,共40次循环;最后，60℃延伸7min。产物行2%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.2.4 免疫印迹技术(Westernblot)检测arresten蛋白的表达 表达产物的SDSPAGE电泳和 Western blotting分析均按常规方法进行。简单过程如下：用去污剂裂解细胞， SDSPAGE蛋白电泳，电转PVDF膜 ，加30g/L脱脂奶粉封闭，PBST洗膜，加兔抗人1∶1 000抗arresten 一抗，室温孵育1h，PBST洗膜;加羊抗兔1∶10000 HRP标记二抗，室温孵育1h，PBST洗膜，混合化学发光试剂1和试剂2加至膜上1min，最后X片显影。

　　2 实验结果

　　2.1 稳定转染的阳性克隆细胞 倒置显微镜下观察发现，阳性克隆细胞细胞形态学与未转染细胞相比无明显变化。

　　2.2 arresten基因的RTPCR鉴定 电泳结果显示，转染阳性质粒pSecTag2arresten组出现长度约的711bp特异性条带，而未转染组及转染pSecTag2组无相应条带 ，该实验结果证实外源性arresten基因成功转染入CHO细胞，见图1。

　　M：marker;1:转染pSecTag2arresten组;

　　2:转染pSecTag2组;3:未转染的空白对照组

　　图1 转染基因的RTPCR鉴定

　　2.3 真核arresten蛋白的表达 Westernblot分析表明，转染阳性质粒pSecTag2arresten组有高表达的arresten蛋白条带，而转染空质粒pSecTag2和未转染的对照组无arresten蛋白表达，该实验结果提示arresten基因已经在CHO细胞获得了稳定表达，见图2。

　　1:转染pSecTag2arresten组;2:转染pSecTag2组;

　　3:未转染的空白对照组

　　图2 arresten蛋白在CHO细胞中的表达

　　3 讨论

　　1971年Folkman提出了“肿瘤的生长必须依赖血管”的著名论点，并逐渐被人们所接受。从那时起，抑制血管生成是抗肿瘤治疗研究的热点。近年来，国内外医学专家研究发现，肿瘤血管是肿瘤细胞生长和转移的形态学基础，肿瘤血管除向肿瘤细胞提供营养外，还不断地向人体其他部位输送肿瘤细胞，导致恶性肿瘤的生长和转移。因此，抑制血管生成是有效的抑制肿瘤细胞生长也转移的的手段。目前，血管生成抑制剂的研究主要有如下4种策略：(1)阻断内皮细胞降解周围基质的能力;(2)直接抑制内皮细胞的功能;(3)阻断血管生成因子的合成和释放，拮抗其作用;(4)阻断内皮细胞表面整合素的作用[2]。arresten是Colorado等在2000年发现的血管生成抑制因子，该因子能够抑制裸鼠移植瘤的生长。arresten与内皮抑素同为来自胶原蛋白的血管生成抑制因子，但与内皮抑素endostatin一样无任何毒副作用，而且它还有arresten自身的优点，它是一种稳定的蛋白质，能够有效的保持其活性，而内皮抑素因其蛋白质的不稳定可能限制其使用，更重要的是，arresten抑制裸鼠移植瘤生长的效果均强于内皮抑素[1]。然而arresten确切的抑制血管生成的具体途径及其相关机制目前并不清楚，而获得该因子是深入进行arresten相关研究的前提。

　　我们在先前研究已经在国内首先获得原核表达的arresten蛋白[3]，原核表达虽产量高，但产物的复性差、活性低，我们用原核表达的arresten进行的相关实验也未得到理想的结果。而CHO细胞是目前较常用的真核表达体系，它可较长时间地表达所携带的基因而不衰减, 并能稳定地大量表达，其表达产生的蛋白质具有糖基化、磷酸化等修饰，具有良好的生物学活性，因此被广泛用于蛋白表达和疫苗生产。我们通过脂质体转染方法行将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得了阳性克隆细胞，随后进行的RTPCR证实我们成功在CHO细胞中导入arresten基因，并通过Westernblot检测到arresten蛋白的表达条带，该结果表明，即我们已成功将arresten成功整合到CHO细胞染色体中，并正常转录和特异表达。这表明我们成功建立了人arresten真核表达细胞克隆体系。在此基础之上，我们可以进行蛋白纯化并获得arresten蛋白，为深入研究arresten的作用机制提供了基础。

　　综上所述，本实验在国内首先成功获得了稳定转染arresten基因的真核CHO细胞克隆，为深入研究arresten因子抑制血管生成的作用途径及其相关机制奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1] Colorado PC, Torre A, Kamphaus G,et al. antiangiogenic cues from vascular basement membrane collagen[J]. Cancer Res, 2000, 60(11):25202526.

　　[2] Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis[J]. Cell，1996,86(7):353364.

　　[3] 关启昌,郑幼伟,宋自芳,等.血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达[J].中国生物工程杂志,2002,22(4)：8992.