卵巢癌中MDR1的表达及其临床意义

　　作者：梁川, 吴绪峰, 陈慧君 作者单位：武汉大学中南医院妇瘤科

　　【摘要】 目的 检测MDR1在卵巢癌中的表达并探讨其在卵巢癌化疗耐药中的作用。 方法 采用RTPCR复合定量技术对40例卵巢癌、20例良性卵巢肿瘤、20例正常卵巢组织中MDR1的表达进行检测，分析其表达与临床病理特征及化疗疗效的相关性。结果 卵巢癌中MDR1的表达显著高于正常组及良性肿瘤组，且肿瘤分化程度越差其表达越高，P<0.05。MDR1在术前化疗组中的阳性表达率显著高于术前未化疗组，P<0.05。MDR1阴性组患者的化疗反应率显著高于阳性组患者(70.6%比43.5%)，P<0.05，MDR1阴性对化疗有效的预测值为70.6%。 结论 MDR1可能在卵巢癌获得性耐药的形成中发挥一定作用，MDR1的检测可能有助于卵巢癌化疗方案的制定，并成为预测化疗疗效的有用指标。

　　【关键词】 卵巢癌;多药耐药基因;逆转录聚合酶链反应

　　Expression of Multidrug Resistance Gene in Epithelial Ovarian Carcinoma and Its Clinical Significance

　　LIANG Chuan, WU Xufeng, CHEN Huijun

　　Gynecologic Oncology Department of Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, China

　　Corresponding Author: Wu Xufeng,Email：wuxufeng@371.netAbstract：Objective To detect the expression of multidrug resistance gene (MDR1) in the epithelial ovarian carcinoma, and investigate its role in drug resistance. Methods The expression of MDR1 in 40 cases of ovarian carcinoma, 20 cases of benign ovarian tumor and 20 cases of normal control were determined by RTPCR technique. The relations between MDR1 expression and the clinicalpathological characteristics as well as chemotherapeutic response were discussed. Results The positive expression rate of MDR1 in ovarian carcinoma was significantly higher than that in benign tumors and normal tissues, and a significant relationship was shown between its expression and pathologic differentiation, P<0.05. The MDR1 positive expression rate in cases received chemotherapy before surgery were significantly higher than in cases who didn't, P<0.05. The response rate in the MDR1 negative group was higher than that in the positive group (70.6% vs 43.5%), P<0.05. The predictive value of negative MDR1 staining for objective response was 70.6%. Conclusion These data suggested that MDR1 may play an important role in the acquired multidrug resistance of ovarian carcinoma. Determination of MDR1 expression may be useful for working out chemotherapy plan and predicting chemotherapeutic response of ovarian carcinoma patients.

　　Key words：Ovarian carcinoma; Multidrugresistance gene; Reverse transcription polymerase chain reaction

　　虽然卵巢癌对化疗相对敏感，但其远期效果并不理想，据报道尽管卵巢癌首次化疗有效率高达76%，但复发后降至20%[1]，药物耐受是化疗失败的重要原因。肿瘤耐药的产生是多基因参与的复杂过程，其中以多药耐药基因MDR1(multidrug resistance gene1)编码产物P糖蛋白(Pglycoproein,Pgp)对药物的排泵最为广泛认可[2]，但其在卵巢癌耐药中的作用尚无定论。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)复合定量技术，检测卵巢癌组织中MDR1mRNA的表达，并结合临床资料分析，探讨其在卵巢癌耐药中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　选择武汉大学中南医院妇瘤科1999年1月30日～2006年12月30日收治的卵巢癌患者40例为实验组，取新鲜组织标本，-70℃保存。早期患者行全面分期探查术;晚期患者行肿瘤细胞减灭术。经组织学确诊，浆液性腺癌21例，黏液性腺癌6例，子宫内膜样癌7例，透明细胞癌3例，未分化癌3例。术前化疗者12例。术后均予铂类为基础的化疗6～8个疗程，采用经典PC方案，具体为：DDP 40～60mg d1～d3; CTX 400～600mg d1～d3，剂量根据病人体表面积进行调整。 以20例妇科良性疾病患者手术切除的正常卵巢为正常对照组，20例良性卵巢肿瘤患者标本作为良性对照组。

　　1.2 试剂及实验方法

　　1.2.1 RNA 抽提 Trizol(购自Intitrogen公司)一步法抽提细胞总RNA，紫外分光光度法检测所有样本的A260/280均大于1.70，甲醛琼脂糖变性电泳鉴定提取RNA质量。

　　1.2.2 cDNA第一链合成 逆转录试剂盒购自东洋纺试剂公司，所有的样本均取1μg总RNA，依次加入5×逆转录缓冲液 4μl，逆转录酶1μl，10pmol/μl的Olig(dT)20 1μl，10mmol/L的dNTP 2μl，RnaseOUT 1μl，DEPC水补至20μl，混均后42℃反应60min，95℃灭活逆转录酶5min，产物于-20℃存放。

　　1.2.3 PCR 扩增 MDR1上游引物5′ACTGAGCCTGGAGGTGAAGA3′，下游引物5′CCACCAGAGAGCTGAGTTCC3′，扩增片段长度390bp。内对照βactin上游引物5′CTACAA TGAGCTGCGTGTGGC3′，下游引物5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′，扩增片段长度260bp。所有样本均取100μg RNA逆转所得cDNA进行扩增，反应总体积25μl，含10×PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，高压纯水13.2μl，上游引物、下游引物各1.5μl，Taq DNA聚合酶2U。94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，计算机凝胶成像系统照相，ID软件分析条带的光密度值，计算MDR1和βactin的比值作为表达水平的参数，行半定量分析。

　　1.3 化疗疗效评定

　　患者完成6～8个疗程化疗后，通过盆腔检查、B超等影像学检查、CA125检测或二次探查术所见评估化疗疗效。标准为：(1)化疗敏感性卵巢癌：初期获临床证实的完全缓解，停药6个月以上未复发者;(2)耐药性卵巢癌：初期达临床完全缓解，但6个月以内出现复发者(CA125升高、体检发现肿块、胸腹水、不明原因肠梗阻等);(3) 持续性卵巢癌：初期对化疗有反应，但进一步检查有残余病灶;(4)难治性卵巢癌：对化疗无效，包括在化疗期间肿瘤稳定或进展。我们将(1)定义为化疗有效，(2)、(3)、(4)定义为化疗无效[3]。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 14.0版软件包行统计学分析。计数资料的比较采用Chisquare检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MDR1在正常卵巢上皮及良、恶性卵巢肿瘤组织中的表达

　　MDR1的扩增片段长度为390bp，βactin的扩增片段长度为260bp，见图1。正常卵巢组织中无MDR1表达，MDR1在良性卵巢肿瘤中的阳性表达率为10.0%，在卵巢癌组织中的阳性表达率为57.5%。MDR1基因在卵巢癌中的阳性表达率显著高于对照组(P<0.01)。定量分析卵巢癌MDR1基因表达水平为0.6685±0.3447，明显高于良性卵巢肿瘤的0.0047±0.0019，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　1、3、5分别为MDR1在卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常

　　2.2 MDR1的表达与临床病理特征之间的关系

　　如表1所示，MDR1的表达与肿瘤分化成程度有关，分化越差表达越高(P<0.01);而与患者年龄、肿瘤组织类型、临床分期均无关(P>0.05)。

　　2.3 MDR1的表达与术前化疗

　　如表2所示，术前化疗组中MDR1的阳性表达率为83.3%，显著高于术前未化疗组(P<0.05)。

　　2.4 MDR1的表达与化疗疗效的关系

　　实验组中化疗敏感性卵巢癌16例;耐药性卵巢癌8例;持续性卵巢癌18例;难治性卵巢癌8例，化疗总反应率为60.00%。如表3所示，MDR1阴性组患者的化疗反应率显著高于阳性组患者(70.6%比43.5%)(P<0.05)。MDR1阴性对化疗有效的 表1 卵巢癌中MDR1的表达与临床病理特征的关系预测值为70.6%;MDR1阳性对耐药的预测值为56.5%。把23例MDR1阳性的患者，根据其表达强度进一步分组(基因表达水平0.3238～0.6685为弱阳性;0.6685～1.0132为强阳性)，则化疗有反应的10例患者中有8例为弱阳性表达，仅有2例为强阳性表达。

　　3 讨论

　　多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞对一种抗癌药物产生抗药性的同时，对结构和功能不同的其他药物产生交叉耐药的现象。国内外研究显示多药耐药基因MDR1的过表达是导致多药耐药的重要原因之一。MDR1定位于染色体7q21.1带，其编码产物Pgp为一能量依赖性药物排流泵，与抗肿瘤药物结合后将药物泵出，使细胞内药物浓度降低而导致耐药，主要与天然来源和脂溶性药物的耐药有关，被称为经典多药耐药[4]。

　　在不同肿瘤中，MDR1表达水平不同。Nooter等[5]将肿瘤分成三组，认为MDR1高表达的肿瘤，如直肠癌等，化疗反应非常低，属天然耐药;MDR1中度表达的肿瘤，化疗反应较前一组好，但易复发且复发者对化疗耐药;不表达或低表达MDR1的肿瘤，化疗可能有效。有关MDR1在卵巢癌耐药中的作用尚无定论，大部分文献报道MDR1在卵巢癌中表达率低[67]。按Nooter的分类原则属第三组，认为MDR1并非卵巢癌原发性耐药关键因素[5]。但有关研究发现MDR1在化疗后或复发患者中的阳性表达明显增高。Hille等[8]的研究表明，卵巢癌组织虽在化疗前低水平表达Pgp，但长期化疗会导致表达增高，引起获得性耐药。Ozalp等[9]的研究亦显示相似结果。体外研究也表明抗癌药物可诱导卵巢癌细胞系中MDR1的表达[10]。本资料显示正常卵巢中无MDR1的阳性表达，说明卵巢并非MDR1的富集器官。在术前未化疗组中MDR1表达量依然较低，表明MDR1在卵巢癌原发性耐药中并不起主导作用。术前化疗患者MDR1的表达显著增高说明化疗可能激发诱导MDR1的表达，提示MDR1可能与卵巢癌的获得性耐药有关，与有关报道结果一致。

　　本研究显示，MDR1在良性卵巢肿瘤表达率低，但在卵巢癌组织中显著增高(77.5%)，且肿瘤分化程度越差其表达越高，表明肿瘤细胞的恶性化转变过程可能会诱导激活MDR1的表达，是否肿瘤的恶性程度越高，则由MDR1介导的药物排泵作用越强，有待进一步研究证实。

　　在卵巢癌的联合化疗中，天然来源和脂溶性药物，如阿霉素等都是较常用药物，尤其是从植物中提取的Taxol，已成为目前一线化疗用药。因此，检测MDR1的表达可能有助于为卵巢癌患者，特别是复发者化疗方案的制定提供依据。然而，目前的研究中MDR1与卵巢癌化疗疗效的关系尚存在争议。Baekelandt等[11]发现卵巢癌中Pgp的表达与化疗疗效显著相关，是患者的独立预后因素;但也有研究显示相反结果[12]，文献报道结果的差异可能与检测手段的不同有关。本研究用RTPCR技术直接检测MDR1的表达，并进行半定量分析，很大程度避免了免疫组化检测蛋白表达所带来的实验误差，结果显示MDR1的表达与化疗疗效显著相关，MDR1阴性者化疗疗效好，其阴性表达对化疗有效的预测值高达70.6%，认为MDR1有可能成为预测卵巢癌化疗疗效的有用指标。

　　本研究中尽管在MDR1阳性的患者中仍有43.5%显示有效，但进一步分组分析后，我们发现化疗有反应的10例患者中有8例为弱阳性表达，仅有2例为强阳性表达。故我们推测有可能MDR1表达量需达到一定强度才能充分发挥药物排流泵的作用，但需要进一步采用更精确定量检测方法进行验证。

　　肿瘤耐药的产生是多基因参与、多步骤综合作用的结果[13]，单一指标的检测无法排除其他因素的影响，对于化疗疗效的预测价值有限，只有通过多基因联合检测，才能更客观全面的针对不同耐药机制筛选高效低毒药物，从而指导个体化化疗方案的制定。

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