灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤血管生成的抑制作用

作者：王筱婧，徐江平，程玉芳 【关键词】  灵芝　　摘要 :目的  研究灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤血管生成的影响，并初步探讨其抑瘤机制。 方法  建立裸鼠移植性人肝肿瘤模型，采用随机区组设计法随机分为空白对照组、阳性对照组及灵芝孢子粉组，观察裸鼠肿瘤生长。采用苏木精-伊红染色法、SP免疫组织化学法及病理Imagepro Plus5.0彩色图像定量分析法检测裸鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）和微血管密度（MVD）。 结果  灵芝孢子粉为2.1g.kg时，对裸鼠移植瘤的抑制率为57.0%，与空白对照组比较有显著差异（P<0.01）。镜下观察，灵芝孢子粉组与空白对照组相比，肿瘤坏死组织较多，细胞异型性较小。灵芝孢子粉组VEGF、MVD表达水平较空白对照组有明显下降。 结论  高浓度及大剂量的灵芝孢子粉对肝肿瘤有明显抑制作用，并能抑制肿瘤新生血管生成，其机制可能与对VEGF表达的抑制有关。　　关键词 :灵芝孢子粉;HepG 2 ;裸鼠;血管生成    Inhibitory and antiangiogenetic effects of Lucid Ganoderma spore on the human hepatocarcinoma transplanted in nude mice  　　WANG Xiao-jing，XU Jiang-ping，CHENG Yu-fang    （Department of Pharmacology，School of Pharmaceutical Science，South Medical University，Guangzhou，Guangdong510515，China）    Abstract:Objective To evaluate the inhibitory effect and antiangiogenetic effect of Lucid Ganoderma spore（LGS）on the growth of the human hepatocarcinoma HepG 2 xenograft in athymic nude mice.Methods The nude mice models of human hepa-tocarcinoma HepG 2 were established and randomly divided into a NS blank control group，a5-FU positive treatment control group and a LGS treatment group.H-E staining，SP immunohistochemistry and quantitative pathologic image analysis system were used to investigate the microvessel density（MVD）and expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）in tumor ti-ssue.Results The in vivo study revealed that LGS produced quite certain therapeutic effect on the growth of the hepatocarcino-ma cell strain（dose:2g.kg，inhibitory rate:57.0%，P<0.01）.Morphologic study showed there were more necrosis and less degree of atypia，decreased MVD and VEGF expression in the LGS group，as compared with that in the blank control group.Conclusion LGS could inhibit the growth and angiogenesis of the transplanted tumor tissue of human hepatocarcinoma HepG 2 in nude mice.Its mechanisms may be related to the reduction of VEGF expression.    　　Key words:Lucid Ganoderma spore;hepatocarcinoma cell strain HepG 2 ;nude mouse;angiogenesis       　　大量的实验研究表明，肿瘤新生血管的形成与肿瘤的生长和转移扩散密切相关［1］ ，肿瘤的血管密度与实体瘤的预后有关。抑制新生血管的形成，则能抑制肿瘤的生长和转移，使肿瘤处于休眠状态［2］ 。灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌，其生长成熟后所散发出来的孢子体即灵芝孢子粉。灵芝孢子粉富含三萜、多糖及微量元素等有效成分。临床报道孢子粉可改善机体的免疫功能，防治癌症，减轻患者对放疗、化疗的不良反应［3～5］ 。近来有报道显示，灵芝提取物对前列腺癌细胞的血管内皮生长因子（VEGF）和肿瘤生长因子β 1 （TGF-β1 ）有抑制作用［6］ 。为了进一步证实其客观疗效并研究其作用机制，本实验选用裸小鼠人肝癌HepG 2 移植瘤模型，观察该药对肿瘤的抑制作用，进一步检测肿瘤组织中VEGF及微血管密度（MVD），研究灵芝孢子粉对肿瘤血管生成的影响。

　1 材料和方法     　　1.1 材料     　　1.1.1 肿瘤细胞株 HepG 2 为人肝癌细胞株，由南方医院肿瘤科生物治疗室提供，用DMEM培养基（含10%小牛血清，青霉素10 5 U.L，链霉素100mg.L），37℃，5%CO 2 培养。    　　1.1.2 实验动物 6～9周龄BALB.C裸鼠30只，体重22～30g，雌雄不拘，无特定病原体（SPF）条件下饲养。由南方医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号No.00736。    　　1.1.3 药品及试剂 灵芝孢子粉，广州盈康科技有限公司提供。5-氟尿嘧啶（5-FU），江苏南通精华制药有限公司产品，批号050307。DMEM培养基，GIBCO公司产品。新生小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号040622，使用前热灭活（55℃，30min）。胰酶，GIBICO公司产品，购于广州晶美生物工程有限公司。青霉素，广州天心药业股份有限公司产品，批号050311。链霉素，华北制药股份有限公司产品，批号041211。兔抗VEGF多克隆抗体，Lab Vision公司产品，目录号RB-9301-P0。 羊抗CD31多克隆抗体，SANTA CRUZ公司产品，目录号sc-1506。抗羊及抗兔SP试剂盒（Kit-9706，Kit-9709）、阳性对照片、DAB显色剂（DAB-0031）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。其他试剂均为国产分析纯。    　　1.1.4 主要仪器 CO 2 培养箱，超净工作台，倒置相差电子显微镜（COIC XDS-1B），Imagepro Plus5.0病理图像分析系统。

　　1.2 方法     　　1.2.1 体内抑瘤实验［7］  取对数生长期的人肝癌HepG 2 细胞，0.25%胰酶消化后，用无血清DMEM配成10 10 cell.L的单细胞悬液。在无菌条件下接种于裸鼠腋窝皮下，0.2ml.只（相当于每只裸鼠接种2×10 6 个肿瘤细胞）。接种1周后可见肿瘤生长，当肿瘤生长到直径为3～4mm时（接种10天以后），将荷瘤裸鼠按肿瘤大小随机分为3组，每组10只裸鼠，雌雄兼有。分组方法采用随机区组设计法，即先按肿瘤体积大小将裸鼠分为大、中、小3组，每组10只，每组裸鼠的肿瘤体积大小相近，然后将大、中、小每个组的裸鼠随机分配到3组中:①空白对照组，生理盐水100ml.kg，腹腔注射，每日给药;②阳性对照组，5-FU用生理盐水稀释，0.02g.kg腹腔注射，隔日给药;③灵芝孢子粉组，灵芝孢子粉用0.5%羧甲基纤维素钠溶液（100ml蒸馏水加入0.5g羧甲基纤维素钠）配制，高压灭菌，2.1g.kg灌胃，每日给药。共给药21天。    　　自接种后每日测量裸鼠体重，每周用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长（a）短（b）径，并按以下公式计算相对体积，V=0.5ab 2 。各组按时间点的平均瘤体积作生长曲线图。    　　末次给药后24h时处死动物，剥离肿瘤称重。进行大体和病理观察。部分肿瘤组织用10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续4μm切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察肝癌细胞坏死、形态改变情况。计算各组抑瘤率，抑瘤率=（1-用药组平均瘤重.空白组平均瘤重）×100%。实验重复2次。    　　1.2.2 免疫组化染色 采用SP法，石蜡标本连续4μm切片，二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，10%枸橼酸盐缓冲溶液煮沸20min抗原修复，兔抗VEGF多克隆抗体工作浓度为1∶500，羊抗CD31多克隆抗体工作浓度为1∶2000，20℃孵育2h，染色步骤按试剂盒内说明进行，DAB显色2～5min，苏木精复染1min，脱水，透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。    　　1.2.3 结果判定 采用Imagepro Plus5.0病理图像分析系统对免疫组化结果进行判定。VEGF以肿瘤细胞胞质内出现棕黄或深黄色颗粒作为阳性判定标准。每张切片于200倍镜下随机选取10个不同视野拍照。MVD计数采取先在低倍镜（×100）下全面观察切片以确定血管密度最高处，再以中倍镜（×200）下每张切片选取10个不同视野拍照。照片结果采用彩色病理图像分析系统Imagero Plus5.0分析。

对VEGF，染色强度评分以灰度值表示，阳性细胞所占的百分比用阳性细胞总面积与视野下所有细胞总面积之比表示，灰度值与阳性细胞面积百分比做相关分析。对MVD，以阳性细胞总面积与视野下所有细胞总面积之比代替微血管计数。VEGF表达 与MVD表达做相关分析。     　　1.3 统计学处理  用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料数据以ˉx±s表示。抑瘤实验结果采用单因素方差分析和t检验，免疫组化实验结果采用单因素方差分析、Pearson及Spearman二元变量相关分析法。检验水准:α=0.05。     　　2 结果     　　2.1 灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤生长的抑制作用  灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤的抑制作用见表1。结果显示，大剂量的灵芝孢子粉对裸小鼠移植瘤的生长具有一定抑制作用，并且对裸鼠体重增加无影响，观察其活动、进食状况均无明显异常，表明灵芝孢子粉对裸鼠的生长并无明显的毒副作用。当灌胃给药剂量为2.1g.kg时，其对裸鼠移植瘤生长的抑制率达到了57.0%。    　　实验期间裸鼠移植瘤体积的生长情况见表2。结果显示，灵芝孢子粉组及阳性对照组裸鼠移植瘤体积的增长速度均明显小于空白对照组，第4周灵芝孢子粉组和空白对照组裸鼠移植瘤的平均体积分别为0.420cm 3 和0.896cm 3 。

　　表1  灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤的抑制作用（略）     　　与空白对照组比较:**P<0.01     　　表2  灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤生长的影响（略）     　　与空白对照组比较:*P<0.05     　　2.2 灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤VEGF、MVD的影响  大体观察发现:空白对照组肿瘤组织体积大，血供丰富，质脆，易出血，界限不清，不易分离，切面呈鱼肉样;灵芝孢子粉组肿瘤组织小，血供不丰富，界限较为清楚。苏木精-伊红染色后镜下观察发现:空白对照组表现为肿瘤组织内见小片坏死，肿瘤细胞生长旺盛，呈条状、索状，细胞核异型性明显，细胞分化较低，间质血管丰富;灵芝孢子粉组表现为肿瘤组织内坏死区增大，肝癌细胞部分呈梭型，间质血管较稀少，有明显的纤维化形成。     　　镜下可见CD31阳性物质于血管内皮细胞质内表达，棕黄色，颗粒状;CD31阳性血管多分布于肿瘤细胞巢周围。镜下观察可发现空白对照组微血管丰富，而灵芝孢子粉组微血管数明显减少（图1A、B）。VEGF阳性物质在肿瘤组织中广泛分布，位于肿瘤细胞质内，并在血管内皮细胞中也有表达，颜色为浅黄色至棕褐色，颜色越深表示表达越强。空白对照组肿瘤细胞染色数目多，颜色较深，棕黄色至棕褐色;灵芝孢子粉组VEGF阳性细胞数目减少，并且颜色呈浅黄色、棕黄色（图2A、B）。 　　图1  裸鼠移植性人肝肿瘤组织MVD标记（免疫组化SP法，×200）（略）    　　A.空白对照组  B.灵芝孢子粉组    　　图2  裸鼠移植性人肝肿瘤组织VEGF的表达（免疫组化SP法，×200）（略）    　　A.空白对照组  B.灵芝孢子粉组     　　2.3 灵芝孢子粉组及空白对照组VEGF及MVD的比较  免疫组化结果显示，灵芝孢子粉组VEGF、CD31表达较对照组明显下调，均有有明显差异（P<0.01），见表3，说明灵芝孢子粉组可明显降低VEGF和CD31的表达。其中对VEGF进行测定时选取的2个变量（阳性面积占总面积比与灰度值）在统计学上具有相关性（r=0.635，Pearson二元变量相关分析法，P<0.01;r=0.588，Spearman二元变量相关分析法，P<0.01），说明其阳性表达的强度与范围呈正相关。灵芝孢子粉组和空白对照组分别将表示VEGF表达水平的2个变量（阳性面积比和灰度值）相乘得到的一个新变量与CD31的表达（以阳性面积百分比为指标）做相关分析，统计学上也具有相关性（灵芝孢子粉组r=0.844，Pearson相关分析法，P<0.01;r=0.799，Spearman相关分析法，P<0.01;空白对照组r=0.613，Pearson相关分析法，P<0.01，r=0.790，Spearman相关分析法，P<0.01），说明灵芝孢子粉组可以通过对VEGF表达的抑制从而使MVD下降。

表3  灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤VEGF及MVD的影响（略）     　　与空白对照组比较:**P<0.01     　　3 讨论     　　本实验中灵芝孢子粉给药剂量为2.1g.kg时，抑瘤率可达57.0%，表明灵芝孢子粉对于裸鼠移植性人肝肿瘤具有一定的抑制作用。并且本实验采用BALB.C-nu品系的裸鼠，无胸腺且功能性T淋巴细胞缺损，免疫功能低下，在此情况下，灵芝孢子粉仍对移植瘤具有一定的抑制作用，说明其作用机制不单单在于提高机体免疫力，更有可能与直接抑制肿瘤生长有关。血管生成是指从已存在的微血管上芽生出新的毛细血管的过程。肿瘤血管生成是肿瘤细胞生长和转移的基础，没有营养血管的支持，肿瘤直径一般不会超过2cm［8］ 。大量研究表明，恶性肿瘤组织的MVD较良性肿瘤组织及正常黏膜组织为高。因此许多学者认为MVD在反映肿瘤预后方面是一个独立而且重要的因素，高MVD往往提示易发生转移和预后不良。本实验结果显示，灵芝孢子粉组MVD的表达明显低于空白对照组，说明灵芝孢子粉能明显降低肿瘤组织MVD表达，从而表现为对肿瘤组织血管生成的抑制。    　　在与肿瘤血管生成相关的细胞因子中，VEGF被认为是最主要的血管生成刺激因子之一，其生物学特性主要表现在增加微血管的通透性并特异性地与血管内皮细胞受体结合，引发一系列信号转导，从而促进血管内皮细胞的分裂和增殖，进而导致新生血管的生成［9］ 。本实验结果显示，灵芝孢子粉组VEGF表达明显低于空白对照组，说明灵芝孢子粉可抑制VEGF的表达。多数研究表明，肿瘤组织中MVD与VEGF表达呈显著正相关，本项实验结果也证明这一点。说明灵芝孢子粉可以通过对VEGF表达的抑制，进而使肿瘤组织MVD降低，发挥抗血管生成的作用。    　　目前，对MVD表达的半定量分析多采用Wei-dner［10］ 于1995年提出的低倍镜下寻找新生血管最密集区，然后在400倍视野下，对每张标本在肿瘤区域内选择3个高密度血管区进行人工计数微血管数目的方法。本实验结果的判定根据上述原理进行了改进，结合Imagepro Plus5.0病理图像分析系统，用阳性面积占镜下所有细胞面积的百分比作为代替微血管计数进行衡量MVD表达的变量，较之传统的在镜下观察的评分方法，可以避免人为因素及不同镜头下细胞数目不同等因素引起的误差，科学性及准确性较高。

　　参考文献 :     　　［1］ Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis depen-dent?［J］.J Natl Cancer Inst，1990，82（1）:426-428.    　　［2］ Kuiper RAJ，Schellens JHM，Blijham GH，et al.Clinical research on antiangiogenic therapy［J］.Pharmacol Res，1998，37（1）:1-16.    　　［3］ 李怡岚，乔姗姗，李国兴，等.灵芝粉抗肿瘤及提高机体免疫力作用的研究［J］.中国慢性病预防与控制，2004，12（4）:156-157.    　　［4］ 韩玉复，宋桂芬，苏 鑫，等.灵芝的研究进展［J］.中药材，1995，18（5）:266-268.    　　［5］ 余素清，吴树勋，刘京生，等.灵芝孢子粉对小鼠免疫功能的影响及抗60 Co辐射效应［J］.中国中药杂志，1997，22（10）:625-626.    　　［6］ Stanley G，Harvey K，Slivova V，et al.Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-β1from prostate cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，330（1）:46-52.    　　［7］ 魏 泓.人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立方法［M］..魏 泓.医学实验动物学.重庆:四川科学技术出版社，2001:595-596.

　［8］ Tsao MS，Liu N，Nicklee T，et al.Angiogenesis correlates with vascular endothelial growth factor expression but not with Ki-ras oncogene ac-tivation in non-small cell lung carcinoma［J］.Clin Cancer Res，1997，3（10）:1807-1814.    　　［9］ 初同伟，王正国，朱佩芳.血管内皮生长因子的基础及临床应用研究［J］.中国临床康复，2002，6（4）:570-571.    　　［10］ Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral mi-crovessel density within brest carcinoma and other solid tumors［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36（2）:169-180.