siRNA对白血病细胞株HEL中EDAG1 基因的干涉作用

　　作者：周颖，程勇，高宗侠，肖敏，冯定庆，沈国栋，凌斌 作者单位：合肥， 安徽省分子医学重点实验室 安徽省立医院分子实验室; 2. 安徽省立医院肿瘤放疗科

　　【摘要】 目的 探讨抑制胚胎发育相关基因-1(EDAG1)的表达对白血病细胞株生长的影响及其机制。方法 收集重组质粒转染包装病毒细胞的上清转染HEL细胞株，经嘌呤霉素筛选稳定抑制EDAG1基因表达的细胞株，RTPCR检测EDAG1基因的抑制情况，运用MTT检测转染细胞的增殖能力，并将稳定转染的细胞株种植到裸鼠皮下检测成瘤情况。结果 成功建立了抑制EDAG1基因表达的HEL细胞株。与HEL/negative相比，HEL/siRNA细胞株增殖速度降低(P<0.05)，接种裸鼠皮下的肿瘤生长明显减慢(P<0.05)。结论 沉默EDAG1基因的表达可以抑制白血病细胞株的增殖，提示EDAG1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点。

　　【关键词】 EDAG1; RNA干扰;白血病;细胞凋亡

　　Effect of siRNA Targeting EDAG1 Gene in Leukemia Cell Line HEL

　　ZHOU Ying1, CHEN Yong2, GAO Zongxia1, XIAO Min1, FENG Dingqing1, SHEN Guodong1，LING Bin1

　　1. Anhui Province Key Laboratory of Molecular Medicine，Molecular Medicine Research Center of Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001, China; 2. Department of Oncological Radiotherapy of Anhui Provincial Hospital

　　Corresponding Author: LING Bin，Email:lingbin.ling@gmail.comAbstract：Objective The purpose of this study is to explore the effects of silence of EDAG1 on the growth of leukemia cell line and its mechanism. Methods HEL was infected by the virus supernatant collected from packing cell line transfected by recombinant retroviral vector, the stable cell lines were selected with puromycin. The reduction of EDAG1 was inspected with RTPCR; and proliferation was assayed with MTT. The tumor growth of the null mice was analyzed after injection HEL/siRNA、HEL/ negative into the skin. Results The stable HEL cell lines with a persistent knockdown of EDAG1 were established. Comparison with HEL/ negative, the proliferation of HEL/siRNA was inhibited significantly(P<0.05), the growth of HEL/siRNA implanted tumor slowed down significantly(P<0.05). Conclusion Inhibition of the expression of EDAG1 can reduce the proliferation of leukemia cell lines，suggesting that EDAG1 may be an effective target for the treatment of leukemia.

　　Key words：EDAG1; RNA interfernce;Leukemia;Cell apoptosis

　　胚胎发育相关基因1(embryonic developassociated gene 1，EDAG1)是定位于9q22的造血系统分化相关基因[1]，研究发现EDAG1基因同时在多种造血系统肿瘤(尤其是红系和巨核系白血病细胞)中高表达，可能与血液肿瘤的发病有关，该基因的高表达通过激活调节核转录因子NFκB调节造血细胞的增殖与分化[24]。本文利用RNA interference(RNAi)干扰技术的高效性和特异性，用逆转录病毒载体直接在红系白血病细胞株HEL内表达特异性针对EDAG1基因的小分子干扰(small interfering RNA, siRNA)，发现沉默EDAG1基因的表达可以有效抑制白血病细胞的增殖。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂 逆转录病毒载体RNAiReady pSIRENRetroQ购自BD公司，重组质粒EDAG1/siRNA(针对EDAG1基因的特异寡核苷酸定向克隆入RNAiReady pSIRENRetroQ， 序列为5′GGATCCGCTCCTAACACATGCCAAGTTTC

　　AAGAGAACTTGGCATGTGTTAGGAG TTTTTTACGCGTGAATTC3′)、EDAG1/ negative(不能形成发夹结构的非特异序列定向克隆入RNAiReady pSIRENRetroQ，序列为5′GGATCCGTGCGTTGCTAGTACCAACTT CAAGAGATTTTTTACGCGTGAATTC  3′)由本室构建并鉴定。脂质体Lipofect2000、总RNA 提取试剂Trizol、嘌呤霉素购自美国Invitrogen公司，小剂量质粒提取试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Promega公司，焦碳酸二乙酯(DEPC)、聚凝胺(Polybrene)、氯喹(Chloroquine)购自美国Sigma公司， TaqDNA聚合酶购自华美生物工程有限公司，上、下游引物由上海生物工程有限公司合成。细胞培养基RPMI 1640、特级胎牛血清均购自美国GIBCO公司。细胞凋亡检测试剂盒apoAlert Annexin VFITC apoptosis kit购自美国BD clontech公司。

　　1.1.2 细胞株 HEL细胞株购自上海细胞所，包装病毒细胞株PT67购自BD公司。稳定转染EDAG1/siRNA、EDAG1/ negative的包装病毒细胞株PT67由本室构建[1]。培养液均含有100mg/L的氨苄青霉素和链霉素，37℃、 5% CO2饱和湿度下培养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组逆转录病毒感染HEL 产病毒细胞株PT67达90%汇合后换成无嘌呤霉素的完全培养基，24h后收集细胞上清，经0.45μm滤膜过滤，滤液立即进行感染。HEL培养至对数生长期，弃去原液，加入1ml产病毒细胞株PT67的细胞上清滤液和1.4μg/ml 的聚凝胺，37℃、 5% CO2条件下培养1h, 重复感染1次, 继续培养24h，更换含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基筛选培养,每3～4天换液,约20天后筛选成活的细胞扩增至完全汇合, 以后改用含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基培养、传代，细胞株命名为HEL/siRNA、HEL/ negtive。

　　1.2.2 RTPCR 提取细胞的总RNA，取定量好的RNA 1μg，根据Promega反转录试剂盒的步骤合成cDNA，将cDNA产物稀释5倍。取5μl做模板，以此模板进行PCR反应，以引物(5′ACA CCT CAT TCT GAA GAC 3′、5′GGG GTA CCT AAA ACA AAA CAT AAC TAT AG 3′)扩增EDAG1基因，以引物 (5′GTGGGGCG CCCCAGGCACCA3′、5′CTCCTTAATGTCAC GCACGATTT3)扩增管家基因βactin作内对照。 PCR扩增体系为94℃ 1min， 50℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 7min延伸，扩增产物在1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.3 细胞增殖实验 收获细胞并计数，用含10%血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度，接种到96孔培养板，每孔200μl，细胞数为1×104。分别培养24、48、96h后加入30μl MTT(5mg/ml)继续培养4h，离心后除去上清加入150μl DMSO，振荡20min后使用酶标仪检测570 nm波长的光吸收值，取4孔的均值。

　　1.2.4 裸鼠成瘤实验 将HEL/siRNA、HEL/negative细胞分别接种到Balb/c裸鼠背部皮下，每只裸鼠接种细胞2×106，注射体积为0.1ml，各接种裸鼠5只。注射后每周观察肿瘤生长状况，分别在第10、20、30、40天测量肿瘤体积：用游标卡尺测量肿瘤块3个方向的直径，分别记为a、b、c，瘤体积计算公式：V=abc×0.4。将细胞接种后裸鼠成瘤的体积进行比较。

　　1.2.5 统计学方法 数据采用统计学软件SPSS10.0进行分析，实验数据以±s表示，组间差异的统计学意义采用配对t检验。

　　2 结果

　　2.1 siRNA对HEL细胞株EDAG1基因表达的抑制分析

　　经RTPCR检测EDAG1 mRNA的表达，与对照组相比，HEL/siRNA细胞株的EDAG1基因的表达明显受抑，抑制率达76.5%，见图1。

　　2.2 siRNA干扰EDAG1 基因的表达对HEL 细胞株增殖的影响

　　与对照组相比，HEL/siRNA细胞株在第4天、第6天的增殖速度明显减慢(P<0.05)，见图2。

　　2.3 裸鼠成瘤实验

　　图2 干扰EDAG1基因的表达对HEL细胞株增殖的细胞株接种第10、20、30、40天测量肿瘤体积，HEL/ negative接种瘤、HEL/siRNA接种瘤体积见图3，显示HEL/siRNA接种肿瘤生长明显缓慢(P<0.05)。

　　3 讨论

　　红细胞和巨核细胞在发育过程中可能来源于同一种造血干细胞，均与转录因子GATA1、GATA2等的表达密切相关，其特征性表面标志(红细胞GlyA、巨核细胞CD41/CD42/CD61)的表达也存在相互交叉现象;在特定因子的刺激下，红细胞可以分化成巨核细胞，巨核细胞也可以转化成红细胞[5]。由于EDAG1基因是转录因子GATA1信号转导途径中的下游基因，而GATA一1是红系、巨核系发育、分化成熟过程中的关键性转录因子[6]，因此，推测EDAG1基因很可能在红细胞、巨核细胞发育中发挥着重要的作用，值得进一步深入研究。

　　本文的研究结果表明抑制EDAG1基因的表达可以有效抑制红系白血病细胞株HEL的增殖，体内成瘤实验表明，低表达EDAG1基因的HEL接种裸鼠肿瘤生长明显减慢。表明EDAG1基因参与调控红系白血病细胞的增殖，而对HEL 细胞中高表达的EDAG1基因的研究发现，该基因编码区结构未发生碱基的点突变、插入或缺失，Southern印迹也未发现EDAG1基因组有重排和扩增现象[4]。据此推测EDAG1的高表达很可能是调控异常造成的。

　　EDAG1基因对增殖的作用可能发生在对G0/G1期的调控[7]。An LL等抑制K562细胞株中EDAG1基因的表达发现，p21的表达水平升高、Bcl2、cmyb的表达则降低，认为EDAG1基因可能是通过调节p21、cmyb的表达作用于G0/G1期，调控白血病细胞的增殖[8]。本研究同时发现EDAG1可能是通过抑制NFκB的激活影响IL8的表达，调控细胞的增殖[9]。由于IL8和NFκB的表达异常将参与造血细胞的分化，使白血病细胞生物学行为发生改变[10]。因此，EDAG1基因可能是白血病治疗的有效靶点之一。

　　【参考文献】

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