survivin选择性剪接变体在人结直肠癌中的表达及其与临床病理参数的关系

　　作者：付文荣,张 勤,程正江 作者单位：湖北襄樊 ,华中科技大学同济医学院附属襄樊医院病理科; 2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科

　　【摘要】 目的 探讨结直肠癌survivin选择性剪接变体表达及其与临床病理参数之间的关系，揭示其在结直肠癌发生发展中的作用及临床意义。方法 RTPCR结合免疫组织化学技术，对survivin各种剪接变体在结直肠癌和癌旁组织中的表达进行了研究，同时还对survivin剪接变体survivin2B及survivinΔEx3表达和临床病理资料作了相关性分析。结果 结直肠癌组织和癌旁组织都表达survivin，并且得到免疫组织化学的证实;survivin2B主要表达于癌旁组织，而survivinΔEx3则主要在癌组织中表达且与肿瘤转移相关。结论 survivin不同变体表达之间的平衡关系可能对肿瘤的发生和发展起重要作用。

　　【关键词】 survivin基因; 剪接变体; 结直肠癌; RTPCR

　　Correlation between survivin Expression and Clinicopathological Factors in Colorectal Cancers

　　FU Wenrong1, ZHANG Qin1, CHENG Zhengjiang2

　　1. Department of Pathology, Xiangfan Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Xiangfan 441021, China; 2. Department of Clinical Medicine, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

　　Corresponding Author：CHENG Zhengjiang, Email：zjcheng11@yahoo.com.cnAbstract：Objective To investigate the expression of survivin variants and their relationship to each other as well as to clinic pathological factors in colorectal cancer. Methods survivin variant specific RTPCR was developed to analysis their expression in 67 paired cancer and paracancer tissues, and the expression of the wildtype survivin at the protein level was further verified by immunohistochemistry. Results All the cases tested expressed survivin mRNA，and immunohistochemistry obtained similar finding. The nonantiapoptostic survivin2B was dominantly expressed in paracancer tissues, whereas the antiapoptostic survivinΔEX3 was more frequently detected in cancer tissues. The expression of survivinΔEX3 mRNA was significantly associated with tumor metastasis. Conclusion The balance between antiapoptostic survivin isoforms and nonantiapoptostic ones may play an important role in tumor genesis and tumor progression.

　　Key words：survivin; Splice variants; Colorectal cancer;RTPCR

　　survivin基因是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的一个独特的成员，具有细胞周期调节和抑制凋亡的双重功能，它几乎在所有的肿瘤组织中表达而在正常组织中却不表达[1]。大量的临床资料表明survivin 的过表达与肿瘤发生和转移相关。survivin是由4个外显子拼接而成的转录本，编码产生142个氨基酸。其两个主要选择性剪接变体是survivin2B和survivinΔEX3[2]。survivin2B在survivin的基础上增加了69bp的外显子2B，编码产生165个氨基酸外显子2B的插入干扰BIR结构域，使survivin2B的抗凋亡活性明显下降。survivinΔEX3被选择剪切掉外显子3，并引起外显子4区域编码顺序的改变，终止密码子后移至3,端非翻译区，编码137个氨基酸，产生增强的抗凋亡活性。我们设计了survivin剪接变体特异引物，用于检测其在结直肠癌中的表达，同时分析各种变体之间以及其表达水平与临床病理资料之间的相关性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 病例来源 67例经病理学确诊的结直癌患者均来自华中科技大学同济医学院附属襄樊医院, 其中男38例，女29例;平均年龄57(34～77)岁,患者术前未经任何化疗或放疗。将一部分手术切取的癌组织和与其配对的癌旁组织(距癌2～3cm)经液氮速冻后转移至-80℃低温冰箱保存至RNA提取。另一部分相应标本经常规福尔马林固定、石蜡包埋切片后用于组织病理和免疫组织化学分析。按TNM方案进行肿瘤临床分期，其中Ⅰ期14例、Ⅱ期19例、Ⅲ期24例和Ⅳ期10例。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 DNA聚合酶及其缓冲液、Mg2+、dNTPs及逆转录试剂盒购自Promega公司，RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司, 20×SYBR GreenⅠ购自OPEC公司，survivin多克隆抗体及SABC(链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物)显色试剂盒购自武汉博士德公司。LightCycler实时荧光PCR分析仪(罗氏公司)。

　　1.1.3 引物设计与合成 采用软件primer3(http://wwwgenome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi)设计引物，其特异性通过检索GenBank证实。为有效区分不同剪接变体，我们将survivin2B和survivinΔEX3的一支引物设计在外显子与外显子的交界处。5′AACTGGCCCTTCTTGGA3′和5′TCGTCATCTGGCTCCC3′用于扩增总survivin(146bp); 5′ATGACGACCCCATGCAAAG3′和5′GGTGGCACCAGGGAATAAAC3′用于扩增survivinΔEX3(173bp); 5′GCGGATCACGAGAGAGGA3′和5′TCTCCGCAGTTTCCTCAAAT3′用于扩增survivinΔEX2B(179bp)。5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′和5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′用于扩增内对照GAPDH(226bp)。以上引物全部由Invitrogen上海公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 cDNA合成 Trizol法提取组织总RNA，按Promega公司逆转录试剂盒说明书合成cDNA，最后用无核酸酶蒸馏水将cDNA稀释至100μl，-20℃保存备用。

　　1.2.2 实时荧光RTPCR法检测survivin mRNA表达水平 反应条件为95℃ 45s预变性, 95℃ 10s变性，58℃ 10s退火，72℃ 20s延伸，45个循环，于72℃ 45s延伸阶段采集荧光信号。系列稀释(1∶40～1∶47)目的基因和内对照基因的cDNA用于评价反应的扩增效率和灵敏度。扩增反应结束后加做熔链曲线和琼脂糖凝胶(3.0%)电泳分析以验证反应的特异性。目的基因表达水平的评价采用Emethod[3]方法进行，结果以相对拷贝数(目的基因mRNA与内对照GAPDH基因mRNA的比值)表示。

　　1.2.3 免疫组化检测 参照博士德公司试剂盒说明书进行。1例survivin表达大于肿瘤细胞50%的Ⅲ期结肠癌切片用作阳性对照，阴性对照不加一抗。

　　1.2.4 统计学方法

　　所有数据在软件SPSS11.0上进行分析处理。两组之间计量资料的对比采用Wilcoxon检验，率的比较采用卡方检验，各剪接变体之间的关系采用Spearman相关分析。设定双尾P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 survivin及其剪接变体的mRNA在癌和癌旁组织中的表达

　　配对的67例癌和癌旁组织中都能检测到survivin。 它们在癌组织和癌旁组织表达的相对拷贝数(均值±SD)为(2.317±1.564)和(0.865±0.776)， 见图1， 癌组织survivin/GAPDH比值明显高于癌旁组织(P=0.003)， survivinΔEX3主要表达于癌组织， survivin2B则主要表达于癌旁组织中。 survivin2B和survivinΔEX3在癌组织中表达的阳性率分别23.9%(16/67)和76.1%(51/67)， 而在癌旁组织中的阳性率则为56.7%(38/67) 和32.8%(22/67)。

　　2.2 免疫组织化学检测survivin蛋白的表达及其与survivin mRNA表达之间的关系

　　survivin蛋白表达于胞浆中。总体来讲，癌组织强表达而癌旁组织呈中度表达，见图2。出乎意外的是，67例中有3例的癌组织表达survivin的强度不及其对应的癌旁组织，都得到mRNA表达水平上的印证，它们对应的癌组织mRNA/癌旁组织mRNA<2.0。由于在各病例之间survivin表达呈高度不均一性，我们将癌组织mRNA/癌旁组织mRNA>2.0设定为强表达。以此为判断依据，我们发现89.6%(60/67) 的病例呈总survivin强表达。

　　2.3 survivin及其剪接变体与临床病理参数之间的关系

　　从表1可以看出，除survivinΔEX3与肿瘤转移相关外，survivin及其各种剪接变体与年龄、性别、肿瘤病理分级和临床分期之间均无统计学上的相关性(P>0.05)。

　　3 讨论

　　结果显示survivin不仅在癌组织中强表达而且在所有的癌旁组织中都有中等强度的表达，而Suga等[4]仅在59.6%(31/52)的相应正常组织中检测到survivin mRNA。原因之一可能是我们选择肿瘤邻表1 survivin及其剪接变体与临床病理参数之间的关系近组织而他们选择较远处的“正常”组织作对照，再者取自癌症患者的癌旁可能早已在分子水平上发生了变化，从而高表达survivin。需要指出的是，尽管总体而言癌组织表达survivin强于癌旁组织(P=0.003)，但个体之间表达水平是不均一的，仍有部分病例癌组织survivin表达水平低于对应的癌旁组织。表明在肿瘤发生和发展过程中survivin基因表达紊乱的机制具有复杂性。

　　因产生多种选择性剪接变体， 使得survivin的表达和功能复杂化。 同以前观察到的survivin2B和survivinΔEX3主要表达于恶性肿瘤结果不同， 我们发现随着从癌旁组织到癌组织survivin2B阳性表达率的降低(56.7%降至23.9%)，survivinΔEX3阳性表达率呈显著上升之势(32.8%升至76.1%)。这暗示在癌变过程中survivinΔEX3和survivin2B起着截然不同的作用。事实上，survivnΔEX3虽然失去外显子3，但仍保留着抗凋亡活性。共表达实验证实survivin ΔEX3与野生型survivin形成异源复合物并募集到线粒体协同发挥线粒体依赖的抗凋亡功能[5]。survivin2B能减弱survivin的抗凋亡活性而使肿瘤对化疗药物敏感，被认为是survivin的天然拮抗物。survivin2B可能通过与survivinΔEX3竞争结合survivin 或直接与survivinΔEX3结合的形式发挥其拮抗作用。在肿瘤组织中survivin2B表达的严重下调将导致来源于同一hnRNA前体的野生型survivin和survivinΔEX3的相对增加。显然在肿瘤组织中抗凋亡剪接变体与促凋亡剪接变体表达水平之间是严重失衡的，这可能是肿瘤发生和发展的一个重要机制。

　　尽管survivin在结直肠癌组织中过表达，但在癌旁组织也有不同程度的表达。Gianani等[6]报道用免疫组织化学方法在结肠的正常、增生、癌前病变和癌组织中都能检测到survivin的存在。这些提示survivin不能用作结肠癌的肿瘤标志物，但我们发现survivin剪接变体在正常组织与肿瘤组织及良性肿瘤与恶性肿瘤之间有着不同的表达模式，survivin剪接变体可能对肿瘤的发生和发展起重要作用。

　　【参考文献】

　　[1] Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel antiapoptosis gene,survivin, expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med, 1997, 3(8):917921.

　　[2] Mahotka C, Wenzel M, Springer E, et al. survivin deltaEx3 and survivin2B: two novel splice variants of the apoptosis inhibitor survivin with different antiapoptotic properties[J]. Cancer Res, 1999, 59(24):60976102.

　　[3] Tellmann G. The EMethod: a highly accurate technique for geneexpression analysis[J]. Nature Methods, 2006, 3: iii.

　　[4] Suga K, Yamamoto T, Yamada Y, et al. Correlation between transcriptional expression of survivin isoforms and clinicopathological findings in human colorectal carcinomas[J]. Oncol Rep, 2005, 13(5):891897.

　　[5] Caldas H, Jiang Y, Holloway MP, et al. survivin splice variants regulate the balance between proliferation and cell death[J]. Oncogene, 2005, 24(12):19942007.

　　[6] Gianani R, Jarboe E, Orlicky D, et al. Expression of survivin in normal, hyperplastic, and neoplastic colonic mucosa[J]. Hum Pathol，2001, 32(1):119125.