MUC2、CDX2在大肠肿瘤中联合表达的意义

　　作者：于秀文，王显艳，孙玉荣，徐广有，张晓杰 作者单位：黑龙江省齐齐哈尔医学院病理教研室

　　【摘要】 目的 探讨粘蛋白MUC2、CDX2在大肠腺癌中的分型及其与临床各个病理因素之间的关系。方法 应用免疫组织化学方法对30例大肠腺瘤、60例大肠腺癌及相应正常大肠黏膜30例进行粘蛋白MUC2、CDX2检测。结果 在大肠正常黏膜、腺瘤、腺癌中，MUC2阳性率分别为100%、93.3%、58.3%;CDX2为90.0%、76.7%、31.7%。根据MUC2和CDX2在大肠腺癌中的表达把大肠腺癌分为四型：MUC2+CDX2+、MUC2+CDX2-、MUC2- CDX2+、MUC2- CDX2-，MUC2+CDX2+型与分化程度、浸润深度、Dukes分期以及生存期相关;MUC2+CDX2-型与淋巴结转移相关;MUC2- CDX2+与临床病理因素不相关;MUC2- CDX2-型与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期以及生存期具有明显的相关性。结论 MUC2、CDX2的下调表达可能参与了大肠腺癌的发生，MUC2+CDX2+、MUC2- CDX2-型大肠腺癌与肿瘤的发生、发展、浸润及转移相关，对临床上判断预后具有较大的意义。

　　【关键词】 大肠肿瘤; MUC2; CDX2; 免疫组织化学

　　Expression and Clinical Significance of MUC2,CDX2 in Colorectal Neoplasm

　　YU Xiuwen, WANG Xianyan, SUN Yurong, XU Guangyou, ZHANG Xiaojie

　　Department of Pathology, Qiqihaer Medical College, Qiqihaer 161042, ChinaAbstract：Objective To investigate the relation between the classification of MUC2 and CDX2 in colorectal adenocarcinoma and its clinical pathological parameters.Methods The expression of MUC2 and CDX2 was detected by immunohistochemistry in 30 specimens of colorectal adenoma, 60 specimens of colorectal adenocarcinoma and 30 specimens of normal colorectal tissues. Results The positive rates of MUC2 in normal colorectal mucosa,colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma were 100%,93.3%,58.3% respectively. CDX2 were 90.0%,76.7%,31.7%. Colorectal adenocarcinoma could be classified into four phenotypes: MUC2+CDX2+, MUC2+CDX2-,MUC2-CDX2+,MUC2-CDX2-.MUC2+CDX2+ showed significant correlation with differentiation, depth of invasion, Dukes staging and survival period. MUC2+CDX2- showed significant correlation with lymph node metastasis. MUC2- CDX2+ showed no significance in relation to all the clinical pathological parameters. MUC2-CDX2- showed significant correlation with differentiation, depth of invasion, lymph node metastasis,Dukes staging and survival period.Conclusion The dawnregulation of MUC2 and CDX2 may participate in the pathogenesis of colorectal adenocarcinoma. Classification of colorectal adenocarcinoma is relevant to the genesis、progression、invasion and metastasis of colorectal adenocarcinoma., which can be used to predict the patients’ prognosis.

　　Key words：Colorectal neoplasm; MUC2; CDX2;Immunohistochemistry

　　大肠癌是由大肠黏膜上皮细胞发生的恶性肿瘤，其发病率在消化道癌中仅次于胃癌和食管癌，也是我国常见的恶性肿瘤之一。近年来，大肠癌发病率呈现不断上升的趋势。大肠癌的发生是大肠黏膜上皮受遗传和环境多种因素作用导致多基因改变的结果，其中黏蛋白2(Mucin 2, MUC2)MUC2和CDX2尾型同源盒转录因子2(Caudalrelatedhememeodomorintranscripoin, CDX2)基因表达异常，其产物MUC2粘蛋白和CDX2蛋白出现了质和量的改变。我们应用免疫组织化学方法对60例大肠腺癌组织中粘蛋白MUC2和CDX2的联合表达进行研究，探讨其作为肿瘤的标志物用于大肠癌诊断、分型以及判断预后的价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　原发性大肠腺癌60例均随机选自黑龙江省肿瘤医院1996年1月～1997年12月手术切除并经病理证实的石蜡包埋组织标本，所有病例均有完整的随访资料。其中男33例，女27例;发病年龄20～75岁，中位年龄52.88岁;发生部位结肠19例，直肠41例;根据1989年WHO肿瘤组织学分类：高分化20例，中分化20例，低分化20例;侵及肌层以上者34例，侵及浆膜和(或)浆膜以外器官26例;有淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者37例;Dukes分期中A期19例，B期13例，C期23例，D期5例;生存期大于5年者32例，小于5年者28例。对照组为同院同期大肠腺瘤及大肠腺癌远切端正常组织(距癌边缘>5cm，经病理证实无癌组织浸润)的石蜡包埋组织标本各30例。每例标本均经HE染色镜下观察。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人MUC2单克隆抗体浓缩液(克隆系Ccp58)、鼠抗人CDX2单克隆抗体浓缩液(克隆系CDX288)及SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒均为北京中山生物技术公司产品。

　　1.3 方法

　　本实验采用免疫组织化学SP法(链酶卵白素—过氧化酶法)。一抗MUC2、CDX2的工作浓度均为1∶50。所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别用HE染色及免疫组织化学染色。以高温高压枸橼酸盐进行抗原修复，DAB显色，其余步骤按说明书操作。以胃癌的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗体作阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　所有切片采用盲法由两位病理科医生独立阅片， MUC2蛋白定位于细胞质，CDX2定位于细胞核，随机观察10个高倍视野，每个视野记数100个细胞，根据其中阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定。(1)按阳性细胞的比率评分：0分为阳性细胞数占总细胞数≤5%;1分为阳性细胞数占总细胞数>5%。(2)按染色深度评分：0分为细胞无棕色颗粒与背景一致;1分为细胞出现明显的棕色或棕黄色颗粒。(3)总积分=阳性细胞的比率评分+染色深度评分：0～1分为阴性();2分为阳性(+)

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析， MUC2、CDX2的联合表达与临床病理因素之间的关系采用χ2检验， P<0.05具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MUC2、CDX2在大肠正常黏膜、腺瘤及腺癌组织中的表达

　　MUC2阳性染色位于细胞质，以核周及核膜明显，有的胞质内呈弥漫性均质性阳性，细胞核不着色，见图1。MUC2在正常大肠黏膜、腺瘤、腺癌中的表达率分别为100%(30/30)、93.3%(28/30)、58.3%(35/60)，经卡方检验正常大肠黏膜与腺癌、腺瘤与腺癌之间分别具有统计学意义(P<0.01)，而正常大肠黏膜与腺瘤之间不具有统计学意义(P>0.05)。CDX2阳性染色位于细胞核，而细胞质不着色，见图2。CDX2在正常大肠黏膜、腺瘤、腺癌中的表达率分别为90%(27/30)、76.7%(23/30)、31.7%(19/60)，经卡方检验正常大肠黏膜与腺癌、腺瘤与腺癌之间分别具有统计学意义(P<0.01)，而正常大肠黏膜与腺瘤之间不具有统计学意义(P>0.05)。MUC2、CDX2在大肠正常黏膜、腺瘤及腺癌组织中的表达情况见表1。

　　2.2 MUC2、CDX2联合表达的各型大肠腺癌与其临床病理因素的关系

　　根据MUC2、CDX2在大肠腺癌中的联合表达情况，把大肠癌分为四种类型：MUC2+CDX2+、MUC2+CDX2-、MUC2- CDX2+、MUC2- CDX2-，各个类型的大肠腺癌与临床病理因素的关系见表2。

　　从表2可以看出， 60例大肠腺癌中， MUC2+CDX2+型占17例， 其与分化程度、 浸润深度、 Dukes分期具有明显的相关性; MUC2+CDX2-型占18例， 其与淋巴结转移具有相关性; MUC2CDX2+为2例，其与临床病理因素不具有相关性;MUC2-CDX2-型为23例，此型大肠腺癌与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期具有明显的相关性，经χ2检验具有统计学意义。

　　2.3 MUC2、CDX2联合表达的各型大肠腺癌与其生存期的关系 表1 MUC2、CDX2在正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠腺癌中的表达 从KaplanMeier生存曲线显示，见图3，MUC2+CDX2+型大肠腺癌生存曲线位于MUC2+CDX2-、MUC2-CDX2-型的上方，具有统计学意义(Log rank=9.857，P=0.002)。说明MUC2+CDX2+型表达与预后呈正相关，即MUC2+CDX2+表达率高者，生存期长。MUC2- CDX2-型的生存曲线亦位于其他组的下方，具有统计学意义(Logrank=11.107，P=0.001)。说明MUC2- CDX2-型表达与预后呈负相关，即MUC2- CDX2-型表达率高者，生存期短。而MUC2+CDX2-型、MUC2- CDX2+型分别与其他类型相比不具有统计学意义(Logrank=0.215，P=0.643;Logrank=1.242，P=0.265)。

　　3 讨论

　　MUC2是肠型粘蛋白[1]，是正常肠道黏液的主要成分，其主要存在于肠黏膜杯状细胞周边部胞质内，核周及核上部胞质明显，而黏液滴则为阴性，阳性染色的杯状细胞形似一“戒指”，而柱状细胞及表面的吸收细胞均为阴性[2]。本研究显示，MUC2表达在正常大肠黏膜上皮杯状细胞的胞质中，与文献报道相同。在大肠腺瘤中，MUC2也表达在瘤细胞的胞质中，核周及核上部胞质明显，而在大肠腺癌中，则呈弥漫性表达。此研究结果说明，从正常大肠黏膜大肠腺瘤大肠腺癌这一发展过程中，MUC2的表达部位出现了差异。产生这种差异的原因可能是由于病变的不同，MUC2出现了糖基化不全或过度糖基化，使抗原的表位充分暴露的结果。在正常情况下，MUC2表达于肠道的黏膜上皮，而在大肠腺瘤、腺癌中表达降低[3]。Ajioka Y等[4]研究结果显示，MUC2粘蛋白在正常大肠粘膜的表达率为100%，在大肠腺瘤表达率降低，且重度不典型增生比轻度不典型增生的腺瘤表达低，但MUC2的表达与腺瘤的肉眼类型无关，MUC2在原发性大肠癌中的阳性表达率为45.2%[5]，而黄文斌等[6]报道，其阳性率为36.5%。本研究显示，MUC2在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌的阳性表达率分别为100%、93.3%、58.3%，呈下调表达趋势，但在正常黏膜和腺瘤之间并无统计学意义。这可能是由于大表2 MUC2、CDX2联合表达的各型大肠腺癌与临床病理因素的关系P<0.01肠腺瘤的例数过少所致，有待于进一步扩大病例深入研究。但从正常黏膜至大肠癌这一过程中，MUC2表达减少这一趋势是存在的。说明MUC2可能参与了大肠肿瘤的发生及恶性转化。

　　CDX2属于同源盒基因的caudal家族，是一种肠型分化的标志物，主要表达于肠上皮细胞、胰腺上皮细胞以及胃和食管的肠上皮化生细胞，而正常食管、胃黏膜和其他正常上皮均无表达[7]。Choi BJ[8]等应用免疫组织化学方法利用组织芯片技术分析123例散发大肠癌患者CDX2的表达结果显示，CDX2表达于相应的正常肠上皮细胞核中，在大肠腺癌中，有29(23.6%)例出现阳性表达，而且和大肠腺癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移相关。Kim GH[9]等通过实时定量PCR方法，检测CDX2 mRNA在正常大肠黏膜、腺癌中的表达及其与临床病理因素的关系中表明，CDX2 mRNA在大肠腺癌中的表达与正常大肠黏膜相比具有统计学意义，而与各个临床病理因素无关。本研究结果显示，CDX2阳性染色位于细胞核中，在正常大肠黏膜、腺瘤、腺癌中的表达率分别为90.0%、76.7%、31.7%，呈现下调表达趋势，但在正常大肠黏膜、腺瘤中的表达无统计学意义，说明CDX2参与了大肠癌的发生，是鉴别大肠肿瘤良恶性非常好的分子生物学标志物之一。

　　MUC2与CDX2具有明显的相关性[10]，Yamamoto H等[11]为了研究MUC2与CDX2的关系，将CDX2基因导入小肠上皮细胞系中，应用RTPCR及EMSA的方法，检测到CDX2可特异性结合于MUC2基因的启动子，显著提高MUC2的表达水平。本文对60例大肠腺癌进行MUC2和CDX2联合检测，研究结果表明，MUC2+CDX2+型大肠癌与分化程度、浸润深度、Dukes分期以及生存期具有明显的相关性，即高分化、未侵及浆膜、Dukes分期为AB期者，MUC2且CDX2蛋白表达水平高。而且KaplanMeier生存曲线说明此型大肠癌对患者有利，提示预后良好。MUC2+ CDX2-型与淋巴结转移具有相关性，说明MUC2+、CDX2-可能参与了大肠癌的转移。MUC2- CDX2+型与临床病理因素不具有相关性，说明MUC2-、CDX2+与大肠癌的生物学行为无关。

　　MUC2- CDX2-型大肠腺癌与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期具有明显的相关性，即低分化、侵及浆膜、Dukes分期为CD期、生存期<5年者，MUC2且CDX2蛋白表达水平低。说明此型大肠癌参与了分化、浸润、转移过程，而且KaplanMeier生存曲线表明此型大肠腺癌对患者不利，提示预后不良。因此，通过联合检测粘蛋白MUC2、CDX2的表达，并对大肠腺癌进行分型，从而全面的分析各个临床病理因素，对于估计患者的预后具有非常重要的价值。

　　【参考文献】

　　[1] Lee SY,Choi DW,Jang KT,et al.High expression of intestinaltype mucin(MUC2)in intraductal papillary mucinous neoplasms coexisting with extrapancreatic gastrointestinal cancers[J].Pancreas， 2006,32(2):186189.

　　[2] Sternberg LR, Byrd JC, Hansson GC, et al. Alternative splicing of the human MUC2 gene[J]. Arch Biochem Biophys,2004,421(1):2133.

　　[3] Mizoshita T,Tsukamoto T,Inada KI,et al. Loss of MUC2 expression correlates with progression along the adenomacarcinoma sequence pathway as well as de novo carcinogenesis in the colon[J]. Histol Histopathol,2007,22(3):251260.

　　[4] Ajioka Y,Watanabe H,Jass JR. MUC1 and MUC2 mucins in flat and polypoid colorectal adenomas[J]. J Clin Pathol,1997，50(4):417421.

　　[5] Yao T,Takata M,Tustsumi S,et al. Phenotypic expression of gastrointestinal differentiation markers in colorectal adenocarcinomas with liver metastasis[J]. Pathology,2002,34(6),556560.

　　[6] Huang WB, Shi LH, Zhu XQ, et al. Expression of mucin MUC1 and MUC2 in colorectal carcinoma and their clinical significance[J].Ai Zheng, 2002,21(11):12311234.

　　[7] Phillips RW,Frierson HF Jr,Moskaluk CA.CDX2 as a marker of epithelial intestinal differentiation in the esophagus[J].Am J Surg Pathol,2003,27(11):14421447.

　　[8] Choi BJ,Kim CJ,Cho YG,et al.Altered expression of CDX2 in colorectal cancers[J]. APMIS, 2006,114(1):5054.

　　[9] Kim GH, Lee DH, Kim HW, et al. Relationships between the expressions of CDX1 and CDX2 mRNA and clinicopathologic features in colorectal cancers[J]. Korean J Intern Med, 2005,20(4):317324.

　　[10]Hu Y, Jones C, Gellersen O, et al.Pathogenesis of Barrett Esophagus: Deoxycholic Acid UpRegulates GobletSpecific Gene MUC2 in Concert With CDX2 in Human Esophageal Cells[J]. Arch Surg,2007,142(6):540545.

　　[11]Yamamoto H, Bai YQ, Yuasa Y.Homeodomain protein CDX2 regulates gobletspecific MUC2 gene expression[J]. Biochem Biophys Res Commun,2003,300(4):813818.