黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤中FUSCHOP mRNA和MDM2、p53蛋白的表达

　　作者：魏万里,王 岩,阮永华,陈 芸,叶 恩 作者单位：昆明医学院第三附属医院病理科;2.昆明医学院病理教研室

　　【摘要】 目的 探讨FUSCHOP mRNA及MDM2、p53蛋白在黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤(MRCLs)组织中的表达。方法 收集经甲醛固定、石蜡包埋的MRCLs组织标本25例。以非MRCLs的脂肪肉瘤及其他软组织肉瘤共18例作对照组。用嵌套式RTPCR的方法检测FUSCHOP融合基因mRNA并做DNA测序证实，以βactin基因作为内对照。用免疫组化SP法检测25例MRCLs 中MDM2、p53蛋白表达情况。 结果 MRCLs组和阴性对照组βactin阳性率分别为72%(18/25)和66.7%(12/18)。25例MRCLs中 15例检出Ⅱ型FUSCHOP融合基因表达，去除βactin阴性病例后阳性率为83.3%(14/18)。对照组18例标本均未检出FUSCHOP融合基因。MRCLs中MDM2、p53蛋白阳性表达率分别为56%(14/25)和44%(11/25),以圆细胞为主的病例组阳性表达率最高，差异有统计学意义。FUSCHOP融合基因与MDM2及p53蛋白表达无相关性;而MDM2与p53蛋白表达呈正相关，有统计学意义。结论 (1)FUSCHOP融合基因是MRCLs的特异性分子遗传标志物，可用于该肿瘤的诊断与鉴别诊断。(2)MRCLs中MDM2、p53蛋白表达与其预后相关。(3)MRCLs中FUSCHOP融合基因与MDM2、p53蛋白的表达无相关性。

　　【关键词】 黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤;TLS/FUSCHOP;MDM2蛋白;p53蛋白

　　Expression of FUSCHOP mRNA and MDM2，p53 Protein in Myxiod/round Cell Liposarcoma

　　WEI Wanli 1, WANG Yan1 , RUAN Yonghua2, CHEN Yun1 ,YE En1

　　1.Department of Pathology，The 3nd Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650118, China;2.Department of Pathology， Kunming Medical CollegeAbstract：Objective To explore the expression of FUSCHOP mRNA and MDM2、p53 protein in Myxiod/round cell Liposarcoma and their significance.Methods Twentyfive formalinfixed, paraffinembedded MRCL samples and 18 control cases retrieved from the archival files were studied. Nested reverse transcriptionpolymerasase chain reaction(RTPCR)technique was employed to detect the FUSCHOP mRNA expression, followed by DNA sequencing to confirm the PCR product. βactin gene was used to assess the quality of the mRNA templates. All of the MRCL cases was available for immunohistochemical analysis of MDM2 and p53 status.Results βactin mRNA was detected in 18 MRCLs(18/25, 72%) and 12 negative control case (12/18,66.7%). TypeⅡ FUSCHOP mRNA was successfully detected in 15 out of 25(60%) MRCLs. All of control cases were negative for the FUSCHOP fusion gene transcripts. The positive rate of MDM2 and p53 proteins were 56%(14/25)and 44%(11/25),respectively.both of them were significantly higher in round cell liposarcoma than them in myxiod and mixed liposarcoma, There was no correlation between FUSCHOP mRNA and the expression of p53、MDM2 protein, but there was a tendency of positive correlation between the expression of MDM2 and p53.Conclusion (1) FUSCHOP is considered as a specific molecular and genetic hallmark for MRCLs and is useful for the diagnosis of MRCLs. (2) The expression of MDM2 and p53 protein is associated with the progression of MRCLs.(3)There is a no correlation between MDM2、p53 and FUSCHOP in MRCLs.

　　Key words：Myxiod/round cell liposarcoma;TLS/FUSCHOP; p53 protein; MDM2 protein

　　黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤(myxiod/round cell liposarcoma, MRCLs)是成人脂肪肉瘤中最常见的类型之一，约占50%左右，常发生在下肢深部软组织和腹膜后。细胞和分子遗传学研究表明，95%以上的MRCLs存在特异性的染色体易位t(12;16)(q13;p11)，即位于12q13的CHOP基因和 16p11FUS基因发生融合，形成FUSCHOP融合基因[1]。同时发现人类12号染色体上还存在多个与脂肪源性肿瘤发生发展相关的基因，如：MDM2和CDK4等[2]，其中最恒定扩增的是MDM2，它除了本身可以导致肿瘤发生外还可作用于p53基因而促使MRCLs发生[3]。Alava等[45]研究发现在一些发生特异性染色体易位的肉瘤中，p53与预后呈明显的负相关。本实验的目的在于探讨FUSCHOP mRNA在MRCLs中的特异性及其与MDM2、p53蛋白表达的关系，并探讨它们与MRCLs发生、发展的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料 收集云南省肿瘤医院病理科1999～2007年间存档MRCLs病例25例，参照Fletch CDM编写的软组织肿瘤组织分类诊断学[5] ，分为以黏液成分为主的9例，黏液圆细胞混合的9例，以圆细胞成分为主的7例，标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。对照组18例，分别为其他亚型脂肪肉瘤4例(包括分化良好型1例，去分化型1例和多形型2例)，滑膜肉瘤3例，低度恶性纤维肉瘤5例，恶性纤维组织细胞瘤2例，黏液脂肪瘤1例，脂母细胞瘤1例，神经鞘瘤伴黏液变1例和黏液软骨肉瘤1例。全部病例均经复查证实。

　　1.2 FUSCHOP融合基因的检测 RNA抽提：抽提方法参照相关文献 [6]。收集5μm厚石蜡包埋组织切片21～25张，为防止污染，用70%乙醇擦洗切片刀及刀架，二甲苯脱蜡至无水乙醇，干燥后加入裂解液(20mmol/L TrisHCL, pH8.0, 20mmol/L edta,2%SDS)200μl。加入20mg/ml蛋白酶K至终浓度100μg/ml, 55℃温浴过夜。组织完全溶解后95℃加热10min灭活蛋白酶K。以下操作严格按照Takara生物工程公司生产的RNA提取试剂盒说明书进行抽提RNA。

　　嵌套式PCR：采用Takara生物工程公司生产的RTPCR二步法试剂盒。严格按照说明进行操作。RT反应条件：42℃ 30min,99℃ 5min。所用PCR引物参考有关文献[6]，本实验所用引物均由上海生物工程有限公司合成，见表1。引物扩增条件：94℃预变性2min，1个循环，94℃变性30s，61℃退火30s, 72℃延伸1min,共40个循环之后，72℃延伸7min。从第一轮PCR产物中吸取1μl再加9μl蒸馏水作为第二轮PCR的模板，第二轮将退火温度改为65℃，其余同第一轮。用蒸馏水作为第一轮的空白对照，用第一轮空白对照产物作为第二轮空白对照。阳性对照为本科室1例经过DNA测序证实含有FUSCHOP融合基因的病例。内对照选用βactin检测RNA的质量，反应体系及扩增条件同上,但仅需作第一轮PCR反应。取第二轮PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳结果。PCR产物进行克隆测序证实(由大连Takara生物工程有限公司协助完成)。表1 PCR引物

　　1.3 免疫组化 免疫组化采用SP法，试剂均购于福州迈新试剂公司。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照，操作步骤按说明书进行。

　　免疫组化结果判定参照有关文献[7], 阳性肿瘤细胞核>10%，肿瘤细胞总数判定为阳性。

　　1.4 统计学方法 数据采用SPSS11.0统计软件进行分析。

　　2 结果

　　2.1 临床病理特征 25例MRCLs中，男15例，女10例(男∶女=3∶2)，最小年龄5岁，最大年龄80岁，平均年龄50.2岁，发病年龄高峰在45～50岁(占58%)。发生部位主要在下肢，共10例(占40%)，其次为盆腔和腹膜后。25例MRCLs镜下显示不同分化阶段的脂肪母细胞，明显交织的毛细血管网和黏液样基质。圆形细胞为主的MRCLs可以见到较多的核分裂相，黏液样基质及血管网较少，见图1、2。

　　2.2 FUSCHOP检测的结果 25例MRCLs中，18例βactin阳性，阳性率72%。对照组βactin阳性12例，有6例未表达βactin，包括3例低度纤维肉瘤，1例脂肪肉瘤，1例滑膜肉瘤，1例神经鞘瘤伴黏液变性。βactin片段大小为343bp，见图3。

　　18例βactin阳性的MRCLs中，15例可检出Ⅱ型FUSCHOP mRNA，阳性率为83.3%，片段大小为103bp，见图4，未能检测到Ⅰ型FUSCHOP融合基因的表达。各组阳性率用χ2检验确切概率法分析差异无统计学意义(χ2=2.107,P=0.460>0.05)。对照组肿瘤均未检测出FUSCHOP融合基因，见表2。表2 MRCLs及对照组FUSCHOP融合基因mRNA表达

　　2.3 免疫组化结果 见图6、7，表3。以黏液为主型病例组MDM2、p53蛋白阳性率均低于混合型和以圆细胞为主型的病例组，差异有统计学意义(χ2=8.090, P=0.015<0.05;χ2=8.666,P=0.01<0.05)。

　　2.4 FUSCHOP融合基因及MDM2、p53蛋白在MRCLs中的表达及相关性分析

　　对MRCLs中FUSCHOP融合基因及MDM2、p53蛋白表达情况进行Spearman相关性分析显示：FUSCHOP mRNA与MDM2、p53蛋白表达均无相关性(χ2=0.5000,P=0.667)。MDM2、p53蛋白表达呈显著正相关(rs=0.995, P=0.0000)。

　　3 讨论

　　3.1 FUSCHOP

　　本实验采用Hisaoka等[6]报道的方法，成功地从15例MRCLs组织中检测到FUSCHOP mRNA表达(均为Ⅱ型融合)，结果与Hisaoka等[6]报道相符，进一步证实FUSCHOP融合基因在MRCLs中呈特异性表达，FUSCHOP融合基因的形成可以作为MRCLs特异性的分子标记物用于MRCLs诊断

　　MDM2、p53蛋白的表达，25例MRCLs中MDM2、p53蛋白阳性表达率分别为56%(14/25)和44%(11/25)，在9例以黏液为主的病例中分别为33.3%(3/9)和11.1%(1/9)，9例混合型病例中均为44.4%(4/9)，7例以圆细胞为主的病例中分别为100%(7/7)和85.7%(6/7);表3 MRCLs 中MDM2、p53蛋白表达

　　研究发现95%以上的黏液样和圆细胞型脂肪肉瘤存在t(12;16)(q13;p11)染色体易位，结果使12号染色体的CHOP基因(也被称为GADD153主要涉及2号外显子)和16号染色体(2,1416,27)的FUS基因(也称为TLS基因主要涉及5、7、8外显子)发生了融合，形成了FUSCHOP融合基因。阳性率为60%(15/25)，去除βactin阴性病例的阳性率为83.3%(15/18)。18例对照病例均未检出FUSCHOP融合基因的表达，及鉴别诊断。MRCLs中圆形细胞是差分化的表现形式，圆形细胞数量越多预示其侵袭性越高。本组病例中16例混合型和圆细胞为主型的MRCLs有11例表达Ⅱ型FUSCHOP mRNA，而9例以黏液为主的病例只有3例表达Ⅱ型FUSCHOP mRNA，结果与以往研究相符，即圆细胞型脂肪肉瘤的融合基因主要为Ⅱ型，支持FUSCHOP mRNAⅡ型可能与预后差有关[8]。也有MRCLs中融合基因亚型和临床病理指标之间无明显相关性的研究报道[9]。因此，关于FUSCHOP融合基因亚型与MRCLs的生物学行为的关系有待进一步研究。

　　3.2 MDM2与p53

　　研究显示脂肪肉瘤特征性的环状和巨大标记染色体由12q1315扩增而来，这一区域最恒定的扩增就是MDM2基因[2]。MDM2蛋白主要功能是与p53蛋白酸性活化域直接结合形成p53-MDM2复合物，从而抑制野生型p53介导的转录激活功能。此外，MDM2基因的酸性活化域具有反式激活作用，此与转录调控有关[10]。关于MDM2、p53在MRCLs中表达，文献报道不一。Smith和Goldblum等[11]用免疫组化方法检测MRCLs中MDM2和p53蛋白几乎是不表达的。与此相反，Dei Tos等[12]在所有的MRCLs实验样本中检测到p53的表达，MDM2的阳性率为56%。本实验观察到，MRCLs 中MDM2和p53阳性率分别为56%和44%，p53与MDM2的表达高度相关(χ2=0.995,P=0.0000)，与Taubert等[13] 、王亚兰等[14]报道的相近，提示MRCLs中存在MDM2和p53蛋白异常表达，MDM2可能是p53的异常表达的影响因素之一。结果还显示，圆细胞型为主的差分化MRCLs中MDM2和p53蛋白阳性表达率明显高于分化较好的黏液为主型和混合型MRCLs，差异有统计学意义(χ2=8.090,P=0.015<0.05;χ2=8.666,P=0.01<0.05)，提示MDM2和p53过表达可能与MRCLs预后不良有关。

　　3.3 FUSCHOP与MDM2、p53的关系

　　虽然MDM2基因与CHOP基因都位于12q1315染色体区域，但本实验结果未提示FUSCHOP融合基因与MDM2、p53蛋白的表达存在相关性(χ2=0.5000,P=0.667)。12q1315染色体区域的基因发生突变是否影响FUS-CHOP融合基因的形成，还有待于进一步研究。

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