非小细胞肺癌PTEN表达与细胞凋亡和增殖关系

作者：于文成 刘伟作者单位：青岛大学医学院附属医院呼吸科,山东 青岛 266003 【摘要】  目的 探讨非小细胞肺癌PTEN蛋白表达与细胞凋亡和增殖的关系及其临床病理意义。方法 采用SABC免疫组化法，检测43例非小细胞肺癌及20例癌旁正常肺组织石蜡包埋标本PTEN蛋白和增殖细胞核抗原（PCNA）表达；用TUNEL法检测细胞凋亡，以增殖指数和凋亡指数表示增殖与凋亡。结果 肺癌组织PTEN蛋白的表达显著低于癌旁正常肺组织（χ2=13.609，P<0.01）,PTEN蛋白的表达与肺癌病人的组织类型及临床分期无关，而与肺癌组织的分化程度、淋巴结转移以及病人的预后密切相关（χ2=5.310～8.503,P<0.05、0.01）;肺癌组织细胞凋亡指数明显高于癌旁正常肺组织(t=8.279,P<0.01),细胞凋亡与肺癌的组织类型、临床分期以及淋巴结转移无关，而与病人的预后及组织分化程度相关（t=2.827、3.114,P<0.05、0.01）;肺癌组织细胞增殖指数明显高于癌旁正常肺组织(t=9.620,P<0.01),细胞增殖与肺癌的组织类型、组织的分化程度以及淋巴结转移无关，而与病人的临床分期、预后密切相关(t=1.993、2.800,P<0.05、0.01);细胞凋亡指数随肿瘤PTEN的表达水平增高而增高，细胞增殖指数随PTEN表达水平增加而降低。结论 PTEN具有诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的双重作用,肺癌PTEN蛋白的低表达及由此导致的细胞凋亡、增殖失衡在肺癌发生发展过程中起重要作用。 【关键词】  肺肿瘤 蛋白质PTEN 细胞凋亡 细胞增殖 免疫组织化学    EXPRESSION OF PTEN AND ITS RELATIONSHIP WITH PROLIFERATION AND APOPTOSIS IN NONSMALL CELL LUNG CANCERYU WENCHENG, LIU WEI  (Department of Respiratory Disease, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of PTEN and its relationship with cell proliferation and apoptosis in nonsmallcell lung cancer (NSCLC). MethodsThe immunohistochemistry stain （SABC） method was applied to investigate the expression of PTEN and PCNA in samples of 43 NSCLC and 20 normal adjacent lung tissues. TUNEL method was applied to detect the apoptosis. The apoptosis index (AI) and mitotic index (MI) were defined. ResultsThe positive rate of PTEN was significantly lower in cancer tissues than in their normal adjacent tissue (χ2=13.609，P<0.01). The expression of PTEN had close relation with the differentiation, lymph node metastasis and prognosis of the disease （χ2=8.503,P<0.01; χ2=5.310,P<0.05; χ2=6.568,P<0.05）, but not related to TNM staging and histological type. The AI of diseased tissues was higher than that of the normal adjacent tissues (t=8.279,P<0.01). No relation was found among AI and TNM staging, lymph node metastasis and tissue differentiation. AI had correlation with differentiation degree and prognosis of the cancer （t=2.827,P<0.05;t=3.114,P<0.01）. The MI of the cancer was higher than that of normal tissues adjacent (t=9.620,P<0.01). There was no relationship between MI and differentiation degree, lymph node metastasis and histological differentiation . MI correlated with TNM staging and prognosis of the carcinoma (t=2.800,P<0.01;t=1.993,P<0.05). The AI increased and the MI decreased with the increase of positive PTEN.ConclusionThe low expression of PTEN in lung cancer results in apoptosis and disequilibrium of proliferation, inducing apoptosis and inhibiting proliferation, plays an important role in the occurrence and development of the disease.

 ［KEY WORDS］ lung neoplasms; protein PTEN; apoptosis; cell proliferation; immunohistochemistry    细胞周期失控是癌变的重要原因。细胞总是处于一种增殖与凋亡的动态平衡中，细胞的增殖和凋亡状态受一系列基因的调控，当促增殖的基因过度表达，促进凋亡基因突变或缺失均会造成增殖和凋亡动态平衡的打破，导致肿瘤的发生。基因控制增殖与凋亡失衡在肺癌发生发展中起主要作用。本研究对PTEN基因在不同组织类型、分化程度、临床分期及预后的肺癌组织标本中的表达进行检测，旨在探讨PTEN基因表达及细胞增殖、凋亡在肺癌发生发展中的作用和它们之间的关系。    1  材料与方法    1.1  标本及其来源    43例肺癌、20例癌旁正常肺组织标本均取自我院手术病理证实标本。43例肺癌病人中，男23例，女20例；年龄41～77岁，平均（59.2±9.7）岁。鳞癌17例，腺癌26例；高分化2例，中分化20例，低分化21例。有淋巴结转移21例，无淋巴结转移22例。按国际抗癌联盟（UICC）1997年肺癌国际分期修正标准进行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例。随访3年，存活19例，死亡24例。    1.2  方法    1.2.1  标本处理  标本均经40 g/L甲醛固定,石蜡包埋,按4 μm厚连续切片4张，1张行苏木精伊红染色，3张分别行PTEN、PCNA免疫组化染色和TUNEL法染色。    1.2.2  PTEN、增殖细胞核抗原（PCNA）以及TUNEL免疫组化染色  采用SABC免疫组化检测技术，严格按照试剂盒说明书进行操作，以PBS替代一抗作为阴性对照，以已知肺癌阳性切片作为阳性对照。    1.2.3  结果判断  PTEN蛋白主要分布在胞浆，细胞浆显示棕黄色颗粒者为阳性。肿瘤细胞核、胞浆均未见棕黄色颗粒为（－）；0～10%癌细胞内可见棕黄色颗粒为（±）；11％～30%癌细胞内可见棕黄色颗粒为（+）；31％～50%癌细胞可见棕黄色颗粒为（）；>50%癌细胞见棕黄色颗粒为（）。以（+）、（）及（）表达作为阳性，以（±）及（－）表达作为阴性。PCNA主要分布在胞核，细胞核出现棕黄色颗粒为增殖细胞。TUNEL染色阳性颗粒位于细胞核内，细胞核出现棕黄色颗粒为凋亡细胞。随意计数5个以上高倍视野，不少于1 000个细胞，以凋亡细胞与总细胞比值作为凋亡指数（AI），增殖细胞与总细胞的比值作为增殖指数（MI）。

    1.3  统计学处理

    数据间比较采用四格表χ2检验和t检验。

    2  结    果

    2.1  肺癌与癌旁正常肺组织PTEN表达、细胞凋亡和增殖情况

    本文43例肺癌组织PTEN阳性20例，阳性率为46.51%；20例癌旁正常肺组织PTEN阳性19例，阳性率为95%，两者相比较差异有显著意义（χ2=13.609，P<0.01）。

    癌旁正常肺组织AI为（1.250±0.775）%，肺癌组织为（4.126±2.088）%,两者比较,差异有显著性(t=8.279,P<0.01)。癌旁正常肺组织细胞MI为（12.325±3.539）%，肺癌组织为（48.642±23.922）％,两者比较,差异有显著意义（t=9.620,P<0.01）。

    癌旁正常肺组织的AI与MI无相关性（r=0.026,P>0.05）。肺癌组织AI与MI比值呈正相关（r=0.622，P<0.01）。肺癌组织MI/AI为11.970，癌旁肺组织为10.956，二者非常接近。

    2．2  肺癌组织PTEN蛋白表达、AI、MI与临床病理的关系

    鳞癌与腺癌PTEN表达、AI和MI差异无显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达、AI和MI与组织类型无关。高中分化肺癌与低分化肺癌比较，PTEN蛋白表达和AI差异有显著性,MI差异无显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达和AI与组织分化程度有关，MI与组织分化程度无关。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期比较，PTEN蛋白表达和AI差异无显著性，MI差异有显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达和AI与TNM分期无关，MI与临床分期有关。肺癌淋巴结转移组PTEN表达与淋巴结无转移组差异有统计学意义，提示肺癌PTEN蛋白表达与淋巴结转移有关。肺癌淋巴结转移组AI和MI与淋巴结无转移组差异无统计学意义，提示肺癌AI与MI与淋巴结转移无关。肺癌存活组PTEN蛋白表达、AI及MI与死亡组比较有显著性差异,提示肺癌PTEN蛋白表达、AI及MI与预后有关。见表1。

  2.3  肺癌PTEN蛋白表达与细胞凋亡和增殖关系

    PTEN阳性的肺癌组织细胞AI为（5.585±1.782）%，阴性者为（2.857±1.399）%，二者比较，差异有显著性(t=5.525,P<0.01)。PTEN阴性的肺癌组织细胞MI为（58.739±23.908）%，阳性者为（35.850±20.043）%，二者比较，差异有显著意义(t=3.558,P<0.05)。

    3  讨    论

    PTEN（或称MMAC1，TEP1）是1997年由STECK等3个研究小组分别发现并命名的一种新的抑癌基因，是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］。它在肿瘤细胞浸润、血管发生以及肿瘤转移中起重要作用［2］。研究发现，PTEN可去除3,4,5三磷酸磷脂酰肌（PIP3）3′位上的磷酸基团，调节丝苏氨酸激酶（Akt）的功能, 对细胞增殖分化具有负调节作用［2,3］。丢失PTEN的细胞会失去这种负调节作用，促进肿瘤的进行性生长。在多种人体肿瘤中均发现PTEN基因的突变和杂合性丢失。KIM等［4］报道，42％～70%的小细胞肺癌和27％～50%的非小细胞肺癌有PTEN的杂合性丢失（LOH）。

    本实验结果显示，肺癌组织中PTEN基因的蛋白表达主要分布在胞浆，在核膜上也有少量着色,癌旁正常肺组织较肺癌组织着色明显增强，肺癌组织PTEN的蛋白表达显著低于癌旁正常肺组织，肺癌PTEN表达下调，提示PTEN蛋白的缺失在肺癌的发生中可能起重要作用；PTEN蛋白表达与肺癌的组织类型、临床分期无关，而与组织的分化程度、淋巴结转移和病人的预后密切相关。MCMENAMIN等［5］报道，PTEN蛋白在前列腺癌中表达水平越低，肿瘤的恶性程度越高；临床分期越晚，预后越差。本实验结果也显示，低分化肺癌PTEN蛋白表达水平低，说明PTEN蛋白表达水平越低，肺癌恶性程度越高。REIFENBERGER等［6］研究发现，PTEN突变的恶性黑色素瘤较未发生突变的黑色素瘤更易发生淋巴结转移。本文实验结果显示，有淋巴结转移的肺癌病人PTEN表达水平明显低于无淋巴结转移者，提示PTEN蛋白低表达的肺癌病人更容易发生淋巴结转移，可能是因为PTEN蛋白缺失的肺癌病人失去PTEN对FAK介导细胞浸润、转移和生长的抑制作用，从而更容易发生淋巴结转移。以上结果提示，PTEN的蛋白表达可以抑制肿瘤细胞的浸润、转移和生长。PTEN蛋白表达与肺癌病人预后的关系至今未见报道。MCMENAMIN等［5］研究发现，PTEN蛋白的丢失严重影响前列腺癌病人的预后。本实验结果显示，PTEN蛋白表达与肿瘤的恶性程度及淋巴结转移密切相关，PTEN蛋白高表达的肺癌病人预后良好，PTEN可以作为判断肺癌病情和预后的指标。

    细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡方式，是受基因编码的细胞主动“自杀”过程，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡在肿瘤发生发展过程中主要起负反馈调控作用，可以阻遏肿瘤细胞的迅速生长。

    STAUNTON等［7］研究发现，不同类型的肿瘤有不同的细胞AI，而且与肿瘤分化、分级、进展和肿瘤的生物学行为有关。本文实验结果与HWANG等［8］报道结果相似。AI与肺癌临床病理特征之间的关系目前研究较少。本实验结果显示，细胞AI与肺癌组织的分化程度密切相关，细胞AI越高，肺癌恶性程度越高。但本实验结果未显示细胞AI与肺癌组织类型、TNM分期有关。LANGENDIJK等［9］报道，细胞AI越高的非小细胞肺癌，越容易发生淋巴结及远处转移。本组资料虽显示淋巴结转移组比非转移组细胞AI高，但无统计学意义。

    细胞AI与肺癌预后的关系报道较少，EEROLA等［10］报道，细胞AI高的手术治疗的大细胞肺癌病人的预后差。本实验资料显示，肺癌死亡组细胞AI较存活组明显增高，提示细胞AI可作为判断肺癌预后的指标。另有文献报道，行放疗肺癌病人中高AI者提示预后良好。提示在临床上可以通过检测细胞AI，选择细胞AI高的肺癌病人行放化疗，或通过转基因技术提高病人对放化疗的敏感性。

 肿瘤细胞增殖活性是指肿瘤组织的增生状态，取决于进入细胞周期的增殖细胞及它们在全体肿瘤细胞所占的比例，是用以反映肿瘤良恶性及恶性程度的重要指标。PCNA也称周期蛋白（cyclin）,是存在细胞核内的一种蛋白质，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用。

    有关PCNA与肺癌的关系，国内外学者作了较多研究。本实验结果与KAWAI等［11］报道的结果相似。目前有关PCNA及MI与肺癌组织类型之间的关系还存在争论，本实验结果未发现MI与肺癌组织类型及淋巴结转移有关，与大多数学者结果一致，认为PCNA的表达仅能反映细胞的增殖状态，与组织类型无关。

    本实验结果显示，癌旁正常肺组织细胞MI明显低于肺癌组织,提示肺癌组织较癌旁正常肺组织细胞增殖明显活跃，这可能也是肺癌得以发生发展的重要机制。有学者研究表明，PCNA表达与肺癌分期相关，分期越晚，PCNA表达越高［10］。本实验结果也显示，PCNA表达与肺癌临床分期密切相关，临床分期越晚，PCNA增殖指数越高。PCNA可作为肺癌早期诊断的参考指标。

    有研究表明，PCNA表达随肺癌的恶性程度增高而增高，PCNA及MI与肿瘤分级呈正相关，提示肺癌PCNA的表达可反映肺癌细胞分化的程度，预示肿瘤恶性度的高低。本实验显示，高分化肺癌较低分化癌MI低，但无统计学意义。OYAMA等［12］报道，PCNA的表达与非小细胞肺癌的预后密切相关，PCNA的阳性表达越强，病人的预后越差。本实验结果也显示，PCNA及MI与肺癌病人的预后密切相关，MI越高，病人的预后越差。PCNA可作为判断肺癌病人病情及预后的指标。

    以往认为肿瘤的发生仅仅是由细胞凋亡减少引起。许多证据证实，在大多数肿瘤，细胞凋亡不是减少了，而是增多了。王洁等［13］报道肺癌组织细胞凋亡较癌旁肺组织明显增多，且随着细胞增殖的增加而增加。本实验结果显示，肺癌组织细胞增殖和凋亡均较活跃，细胞AI与细胞MI呈正相关。推测其机制可能是肺癌恶性细胞无限度增殖，打破细胞增殖与凋亡的平衡，启动了凋亡机制。本实验结果显示，肺癌组织MI/AI比值为11.97，癌旁正常肺组织为10.96，肺癌组织MI/AI值同癌旁肺组织基本一致，提示细胞凋亡随细胞增殖的增加而呈比例增加。本实验结果还显示，癌旁正常肺组织AI与MI无相关性，而肺癌组织AI与MI呈正相关。这也说明肺癌组织细胞凋亡增加是由于增殖增加引起。但因为增殖细胞在数量上远远大于凋亡细胞，凋亡速度不可能跟上增殖的速度，在肿瘤的发生发展过程中所谓细胞凋亡减少是相对过快的细胞增殖而言的，癌细胞过度增殖及凋亡的相对不足在肺癌的发展过程中起重要作用，这可能是肿瘤得以迅速发展的原因之一。

    PTEN蛋白与细胞凋亡的关系至今未见报道。本实验结果显示，PTEN蛋白阳性表达的肺癌细胞AI明显增高，MI明显降低,提示PTEN蛋白在肺癌具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的双重作用。在众多抑癌基因中，具有双重抑癌作用者是不多见的，已有研究将PTEN作为靶基因用于肺癌基因治疗中。因此，PTEN很有可能成为将来肺癌转基因治疗最为有效的基因之一。

    PTEN是通过诱导细胞凋亡和抑制癌细胞增殖双重作用来抑制肺癌发生发展过程的。而细胞增殖与凋亡又是癌细胞周期失控发生癌变的根源。基因治疗癌症是一种新的有效方法。目前主要是难以筛选出一种较为有效的靶基因。PTEN可能成为今后肺癌基因治疗最为重要的靶基因。

【参考文献】  ［1］ LI J, YEN C, LIAW D, et al. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer ［J］. Science, 1997，275(5308):19431947.

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　　［8］ HWANG J H, LIM S C, KIM Y C, et al. Apoptosis and bcl2 expression as predictors of survival in radiationtreated nonsmallcell lung cancer［J］. Int J Radiation Oncol Biol Phys， 2001,50(1):1318.

［9］LANGENDIJK H, THUNNISSEN E, ARENDS J W, et al. Cell proliferation and apoptosis in stage Ⅲ inoperable nonsmall cell lung carcinoma treated by radiotherapy［J］. Radiother Oncol, 2000,56(2):197207.

［10］ EEROLA A K, RUOKOLAINEN H, SOINI Y, et al. Accelerated apoptosis and low bcl2 expression associated with neuroendocrine differentiation predict shortened survival in operated large cell carcinoma of the lung ［J］. Pathol Oncol Res， 1999,5(3):179186.

［11］KAWAI T, SUZUKI M, KONO S, et al. Proliferating cell nuclear antigen and ki67 in lung carcinoma. Correlation DNA flow cytometric analysis［J］. Cancer, 1994,74:24682475.

［12］ OYAMA T, MITSUDOMI T, MIZOUE T, et al. Proliferating cell nuclear antigen may be superior to argyrophilic nucleolar organized regions in predicting shortened survival of patients with nonsmall cell lung cancer［J］. Surg Oncol, 1995,4:8387.

［13］王洁,王曾礼,陈明易,等. 肺癌细胞凋亡及相关基因与其预后关系的初步研究［J］. 中华结核和呼吸杂志, 1997,20(3):141144