脾源性酪氨酸激酶Syk的抗肿瘤作用

　　作者：齐义新，胡 洁，宋小天，单保恩 作者单位：石家庄，河北医科大学第四医院外科;2. 河北医科大学免疫教研室;3. 河北医科大学第四医院科研中心

　　【摘要】 目的 探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)的体内外抗肿瘤作用。方法 经脂质体介导将全长Syk cDNA转入Syk阴性表达的高侵袭性人乳腺癌细胞株MDAMB231，应用MTT法、Transwell小室法分别检测Syk cDNA体外抗肿瘤细胞增殖及侵袭迁移作用;采用BABL/c(nu/nu)裸鼠皮下移植瘤模型，检测转染及未转染肿瘤细胞的成瘤及肺转移情况。结果 转染全长Syk cDNA的MDAMB231细胞与转染空载体及未转染MDAMB231细胞相比，体外增殖情况未见明显改变，而侵袭及迁移实验中的穿膜细胞数(总迁移细胞数/5HPF)却均明显减少(P<0.05);同样，接种不同肿瘤细胞的裸鼠皮下移植瘤成瘤情况未见明显差异，但接种转染组肿瘤细胞的肺转移率却显著低于未转染组及空载体转染组(P<0.05)。结论 Syk通过改变乳腺肿瘤细胞的侵袭迁移能力参与其抗瘤作用。

　　【关键词】 脾源性酪氨酸激酶; 乳腺肿瘤; 侵袭转移; MDAMB231

　　AntiTumor Effect of Spleen Tyrosine Kinase

　　QI Yixin1, HU Jie2, SONG Xiaotian3, SHAN Baoen3

　　1. Department of Surgery, The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China;2. Department of Immunology，Hebei Medical University;3. Scientific Research Center, The Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University

　　Corresponding Author: SHAN Baoen, Email:baoenshan@yahoo.com.cnAbstract：Objective To investigate the antitumor effect of spleen tyrosine kinase (Syk) in vitro and in vivo. Methods Human breast cancer cell line MDAMB231 which expressing Syk negatively was cultured in optimum medium and transfected with Syk cDNA by liposome,and cells transfected with blank vector were used as control. The inhibited effect of Syk cDNA on the cell proliferation and the ability of assorting in vitro was detected by MTT and TranswellECM methode; the pulmonary metastasis and tumor growth of transformed and untransformed human breast cancer cells were investigated by xenografts in BABL/c (nu/nu) athymic mice. Results There is no obviously change in proliferation in vitro,between the MDAMB231 cells transformed Syk cDNA and transformed idling or not transformed,but number of the migrating cells (migrating cells/5HPF) reduces obviously in invasion and immigration experiment (P<0.05); in the same, there is no difference in tumor growth of athymic mice inoculated different cancer cells, nevertheless, there is lower incidence of pulmonary metastasis in the group of inoculated cancer cells transforming Syk cDNA (P<0.05). Conclusion Syk can restrain in tumor by reducing the abilities of invasion and migration of breast cancer cells.

　　Key words：Spleen tyrosine kinase; Breast cancer; Invasion and metastasis; MDAMB231

　　非受体型脾源性蛋白酪氨酸激酶Syk(spleen tyrosine kinase，Syk)，作为B细胞活化信号转导过程中重要的分子而被广泛研究。近来，越来越多的证据表明，Syk可能是乳腺癌细胞潜在的候选抑制因子[1]。我们曾报道[2]，Syk表达降低或缺失与乳腺癌发生发展及不良预后有关，但其确切作用机制尚不十分清楚。本研究通过将Syk cDNA体外转染Syk阴性表达的高侵袭性乳腺癌细胞株MDAMB231[3]，检测Syk cDNA的抗肿瘤作用，为进一步研究其临床应用价值提供理论及实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株和实验动物 人乳腺癌细胞株MDAMB231由河北医科大学第四医院科研中心保存，以含10%胎牛血清(FCS)的DMEM培养基，于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，以对数生长期细胞为实验标本。BALB/c(nu/nu)裸鼠15只，雌性，4周龄，重量10～16g，购于中国医学科学院实验动物中心。

　　1.1.2 主要试剂 DMEM培养基及胰蛋白酶为美国Gibco公司产品;TRIzol及转染试剂盒PlusTM Reagent为美国Invitrogen公司产品;鼠抗人Syk抗体为美国LAB VISION公司产品;Matrigel为美国BD公司产品;Transwell板为美国Costar公司产品;重组质粒pcDNA3.1D/V5HisTOPO/Syk为河北医科大学第四医院科研中心构建。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Syk cDNA转染MDAMB231细胞的制备重组“pcDNA3.1D/V5HisTOPO/Syk”真核表达质粒采用DNA重组技术从Syk(+)人乳腺癌细胞株MCF7中获取所需目的基因自行构建而成(文章待发表)，经脂质体介导转染MDAMB231细胞，G418(800mg/L)有限细胞稀释法筛选阳性克隆。

　　1.2.2 Western 印迹鉴定Syk 蛋白在转染细胞中的表达 提取细胞总蛋白，行SDSPAGE电泳(5%浓缩胶，80V, 10%分离胶，120V，3h)，再行PVDF印记电泳(90V，3.5h)转膜，丽春红染液预染洗涤封闭后，加鼠抗人Syk mAb，4℃过夜后洗涤，加辣根过氧化酶标记的二抗(羊抗鼠IgG)，DAB显色试剂盒显色，拍照记录实验结果。

　　1.2.3 MTT法检测转染Syk cDNA对MDAMB231细胞增殖能力的影响 收集对数生长期的不同MDAMB231细胞，以1×104/孔浓度接种于96孔培养板，各组细胞(MDAMB231/Syk，MDAMB231/pcDNA3.1及MDAMB231细胞)均做6复孔，37℃、5% CO2条件下连续培养7天，每24h随机选择6孔加入MTT(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h后弃上清;加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，充分溶解结晶;酶联免疫检测仪测定492nm波长的光吸收值(A492nm)，并以培养时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

　　1.2.4 细胞侵袭实验 以人工基底膜胶Matrigel(50mg/L)包被Transwell小室(装有聚碳酸酯膜，孔径8μm)底部，上室加入终浓度为5×105/ml的细胞悬液200μl，对应下室加入含50ml/L FCS的DMEM培养液，每组重复3个样品，常规培养24h，甲醛固定，HE染色，棉签擦去微孔膜上层细胞，倒置显微镜下计数穿膜细胞数目判定其穿越侵袭人工基底膜的能力。以“总迁移细胞数/5HPF”记录结果。

　　1.2.5 细胞迁移实验 无需Martrigel包被，其余操作同侵袭实验。

　　1.2.6 Syk cDNA对裸鼠皮下移植瘤生长及肺转移的影响 收集对数生长期各组细胞悬液，调整细胞悬液浓度至5×106/ml，取0.5ml接种于裸鼠背部皮下组织内，观察各组裸鼠生长状况和(或)出瘤时间。当MDAMB231组肿瘤长至500mm3左右时，断颈处死全部动物，取肿瘤组织，测量肿瘤最大直径及相对应的横径。根据公式V=π/6×肿瘤直径(mm)×肿瘤横径(mm)，计算肿瘤大小并称重;取肺组织，10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，显微镜下观察细胞。

　　1.2.7 统计学方法 数据以SPSS13.0软件进行单因素方差分析，结果以±s表示，两两比较用q检验。

　　2 结果

　　2.1 Syk蛋白在MDAMB231/Syk细胞中的表达

　　Western 印迹结果显示，MDAMB231/Syk细胞表达Syk蛋白，而MDAMB231/pcDNA3.1及MDAMB231细胞均不表达Syk蛋白，见图1，提示Syk基因转染成功。

　　2.2 转染Syk cDNA对MDAMB231细胞体外增殖能力的影响

　　MDAMB231/Syk、MDAMB231/pcDNA3.1及MDAMB231细胞在体外连续培养7天中，细胞增殖活性比较差异均无统计学意义(P>0.05)(数据未显示)，提示转染Syk cDNA对MDAMB231细胞的体外生长增殖能力无影响。

　　2.3 转染Syk cDNA对MDAMB231细胞体外侵袭迁移能力的影响

　　MDAMB231/Syk与MDAMB231/pcDNA3.1及MDAMB231细胞相比，侵袭实验及迁移实验中的穿膜细胞数(总迁移细胞数/5HPF)均明显减少(P<0.05)，见图2、3。

　　2.4 转染Syk cDNA对MDAMB231细胞接种裸鼠皮下移植瘤生长的影响

　　裸鼠皮下接种不同MDAMB231肿瘤细胞后， 3天即有肿瘤生长， 至第30天， 断颈处死所有小鼠， 剥离肿瘤， 测量大小并称重， 各组间差异无统计学意义(P>0.05)(数据未显示)， 提示转染Syk cDNA对MDAMB231细胞在裸鼠体内增殖无明显影响。

　　2.5 转染Syk cDNA对MDAMB231细胞于裸鼠皮下移植瘤肺转移的影响

　　皮下接种MDAMB231细胞的5只小鼠全部发生肺转移(100%);接种MDAMB231/pcDNA3.1细胞组的5只小鼠，4只发生肺转移(80%);而MDAMB231/Syk 组的5只小鼠中只有2只发生了肺转移(40%)，结果提示，转染Syk cDNA可以显著降低MDAMB231细胞裸鼠皮下移植瘤肺转移发生率(P<0.05)，见图4。

　　3 讨论

　　2000年，Coopman等[1]首次证明脾源性蛋白酪氨酸激酶Syk可能是人乳腺癌细胞潜在的生长调节抑制因子，从而引发了众多学者的关注。我们前期的研究结果亦已显示，Syk表达降低或缺失与乳腺癌发生发展及不良预后有关，但其确切作用机制尚不十分清楚。本研究将全长Syk cDNA体外转染Syk阴性表达的高侵袭性乳腺癌细胞株MDAMB231，MTT及裸鼠皮下移植瘤实验乳腺癌的发生是复杂且多因素的。最近，有报道指出一些新的分子与其发生、发展有关，如CBFA2T3、15PGDH、FBXO31、Wwox、HIN1、Syk等[411]。本研究结果显示，转染Syk cDNA对MDAMB231肿瘤细胞体内、外生长增殖能力均无影响。

　　进而，我们又利用Transwell小室和 Matrigel胶建立了体外侵袭迁移模型。Matrigel是大鼠 ESH 肉瘤细胞外基质提取物，由Ⅳ型胶原、层粘蛋白、硫酸肝磷脂蛋白多糖及整合素等组成，其成分与组织基底膜相似。Transwell小室分为上下两层，中间以聚碳酸酯滤膜(微孔直径为 8μm)相隔。滤膜上的微孔允许肿瘤细胞穿越，迁移的细胞可黏附于膜下层，计数并比较穿膜细胞数，可在一定程度上反应肿瘤细胞的迁移能力。而将Matrigel作为黏附基质，铺于聚碳酸酯滤膜，则可模拟基底膜构造，同样可以通过计数并比较穿膜细胞数，评价肿瘤细胞的侵袭能力。结果显示，转染Syk cDNA的MDAMB231细胞穿膜细胞数明显少于转染空载体组和未转染组细胞，说明Syk cDNA可明显抑制转染细胞的迁移及侵袭能力。裸鼠皮下移植瘤肺转移模型的实验结果同样证明，转染Syk cDNA可以显著降低MDAMB231细胞裸鼠皮下移植瘤肺转移的发生率。

　　总之，本研究进一步确证了Syk的抗肿瘤细胞侵袭转移作用可能是其与乳腺癌不良预后有关的重要因素。

　　【参考文献】

　　[1] Coopman PJ,Do MT,Barth M,et al.The Syk tyrosine kinase suppresses malignant growth of human breast cancer cells[J]. Nature, 2000,406(6797):742747.

　　[2] 齐义新，胡洁，宋振川，等. 乳腺癌组织中Syk 表达及其与其临床病理关系研究[J]. 中国肿瘤临床，2005, 32(24);13861388.

　　[3] Toyama T, Iwase H, Yamashita H, et al. Reduced expression of the Syk gene is correlated with poor prognosis in human breast cancer[J]. Cancer Lett, 2003,189(1)：97102.

　　[4] Kochetkova M, McKenzie OL, Bais AJ, et al. CBFA2T3 (MTG16) is a putative breast tumor suppressor gene from the breast cancer loss of heterozygosity region at 16q24.3[J]. Cancer Res,2002,62(16):45994604.

　　[5] Wolf I, O'Kelly J, Rubinek T, et al. 15hydroxyprostaglandin dehydrogenase is a tumor suppressor of human breast cancer[J]. Cancer Res,2006,66(15):78187823.

　　[6] Kumar R, Neilsen PM, Crawford J, et al. FBXO31 is the chromosome 16q24.3 senescence gene, a candidate breast tumor suppressor, and a component of an SCF complex[J]. Cancer Res,2005,65(24):1130411313.

　　[7] Bednarek AK, KeckWaggoner CL, Daniel RL, et al. WWOX, the FRA16D gene, behaves as a suppressor of tumor growth[J]. Cancer Res,2001,61(22):80688073.

　　[8] Nunez MI, LudesMeyers J, Abba MC, et al. Frequent loss of WWOX expression in breast cancer: correlation with estrogen receptor status[J].Breast Cancer Res Treat,2005,89(2):99105.

　　[9] Krop I, Maguire P, LahtiDomenici J, et al. HIN1, a putative cytokine highly expressed in normal but not cancerous mammary epithelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(17):97969801.

　　[10]Krop I, Parker MT, BloushtainQimron N, et al. HIN1, an inhibitor of cell growth, invasion, and AKT activation[J].Cancer Res,2005,65(21):96599669.

　　[11]Stewart ZA, Pietenpol JA. Syk:a new player in the field of breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2001,3(1):57.