辛基酚对MCF7乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响

　　作者：彭俊华, 张华欣, 张 峰，赵 勇，樊红艳 作者单位：兰州军区兰州总医院检验科

　　【摘要】 目的 观察辛基酚对MCF7乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响。方法 以MTT试验、流式细胞分析、免疫细胞化学和RTPCR等方法观察辛基酚对MCF7乳腺癌细胞增殖、细胞周期相和细胞凋亡、CDK2和CDK4 mRNA表达、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达的影响。结果 4、8、16μmol/L OP作用MCF7乳腺癌细胞72h时，细胞增殖率分别为107.31%、168.06%、62.00%，G0/G1期细胞分别为(52.46±6.67)%、(50.19±7.39)%、(67.31±5.47)% ，对照组(55.27±7.53)%，细胞凋亡率分别为(4.84±1.12)%、(6.48±1.36)%、(19.26±3.57)%， 对照组(5.56±1.125)%，16μmol/L OP减少了细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1的表达。结论 4、8μmol/L OP促进MCF7乳腺癌细胞增殖，16μmol/L OP则抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，这可能与OP影响细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1表达有关。

　　【关键词】 乳腺癌;辛基酚;细胞周期蛋白1;细胞周期依赖性激酶类

　　Effect of Octylphenol on Cell Cycle and Cyclin Expression on MCF7 Breast Cancer Cells

　　PENG Junhua, ZHANG Huaxin, ZHANG Feng, ZHAO Yong, FAN Hongyan

　　Department of Clinical Laboratory, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, PLA,Lanzhou 730050, ChinaAbstract：Objective To observe the effect of octylphenol(OP) on cell proliferation, cell cycle and cyclin expression of MCF7 breast cancer cells.Methods Using MTT test, flow cytometry, immunocytochemistry and RTPCR to observe the changes of cell proliferation, cell cycle, apoptosis, CDK2,CDK4 and Cyclin D1 mRNA expression, Cyclin D1 protein expression of MCF7 cells.Results When MCF7 breast cancer cells were treated with 4，8 and 16μmol/L OP on 72h, the proliferation ratio of MCF7 was 107.31%、168.06% and 62.00% respectively, MCF7 cell at G0/G1 were (52.46±6.67)%、(50.19±7.39)% and (67.31±5.47)% respectively,while control group was (55.27±7.53)%. The apoptosis ratio of MCF7 was (4.84±1.12)%，(6.48±1.36)% and (19.26±3.57)% respectively，and the control group was (5.56±1.125)%. The expression of CDK2,CDK4 and Cyclin D1 mRNA significant decreased when MCF7 breast cancer cells were treated with 16μmol/L OP, the expression of Cyclin D1 protein decreased too.Conclusion The proliferation of MCF7 breast cancer cells increases when treated with 4，8μmol/L OP, but it decreases when treated with 16μmol/L OP. These different effects on MCF7 cells maybe related to the expressive regulation of CDK2, CDK4 and Cyclin D1.

　　Key words：Breast cancer; Octylphenol; Cyclin D1; Cyclindependent kinases

　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率呈上升趋势，乳腺癌的发病与遗传、雌激素和环境因素有关。辛基酚(octylphenols，OP)是一种具有雌激素活性的化工产品，在低浓度时能促进MCF7乳腺癌细胞的增殖，高浓度时却抑制MCF7细胞的增殖[1]。细胞增殖与细胞周期密切相关。本研究将OP作用于MCF7细胞，观察细胞的增殖和CDK2、CDK4、Cyclin D1表达的改变，探讨OP影响MCF7乳腺癌细胞增殖的作用机制，为乳腺癌的防治提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　辛基酚，纯度>98%，Sigma公司产品。兔抗人抗体Cyclin D1 (使用浓度为1∶75)，羊抗兔SP试剂盒，北京中杉公司产品。RTPCR试剂盒，上海Sangon公司产品。二甲亚砜(DMSO)，纯度>98%，进口分装试剂，用于配制OP。

　　1.2 MCF7细胞培养及分组

　　人乳腺癌MCF7乳腺癌细胞由中科院上海细胞所提供。试验前将乳腺癌MCF7细胞在无酚红的DMEM/F12中培养24h以耗尽细胞的内源性雌激素，然后以该培养基进行试验。试验分为四组：对照组(Con)，给予DMSO、 4μmol/L OP组(OP4)、8μmol/L OP组(OP8)、16μmol/L OP组(OP16)。

　　1.3 MTT试验

　　参见文献[2]，以492nm波长测定活细胞的吸光度(A)，增殖率(PR)= 实验组A值/对照组A值×100%。

　　1.4 细胞周期相检测

　　实验各组细胞处理72h，收获细胞，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测。

　　1.5 Cyclin D1蛋白表达检测

　　细胞生长于小盖玻片上，多聚甲醛固定，血清封闭，加一抗于37℃孵育50 min，按SABC试剂盒操作，DAB显色，脱水、透明，显微镜观察并照相，数据分析。

　　1.6 荧光定量PCR检测CDK2、CDK4和Cyclin D1的mRNA表达

　　收获OP作用48h细胞，用Trizol试剂一步法提取总RNA，逆转录为cDNA。引物由上海生工公司合成，用荧光杂交探针标记。CDK2：5′GCT CTC ACT GGC ATTCCT CCT3′，5′CGA AAT GAA GGC ACT AGA GC3′;CDK4：5′CTA CCT CTC GAT ATG AGC CAG T3′，5′CAT CTG GTA GCT GTA GAT TCT G3′;Cyclin D1：5′GAG GAA CAG AAG TGC GAG GA3′，5′TCT GGA GAG GAA GCG TGT GA3′。取样本总cDNA 3μl、上游和下游引物各1.5μl，加入试剂盒其他成分，用PE Gene Amp 5700 荧光PCR检测仪进行分析。反应条件为94℃ 40s、60℃ 40s、72℃ 40s，40个循环。

　　1.7 统计学方法

　　数据用±s表示，组间差异性比较用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析。

　　2 实验结果

　　2.1 辛基酚对MCF7 乳腺癌细胞增殖的影响

　　4、8μmol/L的OP能促进MCF7乳腺癌细胞增殖,16μmol/L 的OP却抑制细胞增殖;OP作用72h，MCF7乳腺癌细胞的增殖率分别为107.31%、168.06%、62.00% ，见表1。表1 OP对MCF7乳腺癌细胞增殖的影响 n=3, *P<0.01，vs Con2.2 辛基酚对MCF7乳腺癌细胞周期相分布的影响

　　流式细胞分析结果显示，OP对细胞周期的影响较小，16μmol/L OP将MCF7乳腺癌细胞阻滞于G1/G0期，72h时细胞凋亡率明显增加，见表2。表2 OP对MCF7乳腺癌细胞周期相的影响

　　2.3 OP对MCF7乳腺癌细胞中Cyclin D1蛋白表达的影响

　　16μmol/L OP明显下调MCF7乳腺癌细胞中Cyclin D1表达，8μmol/L OP上调MCF7乳腺癌细胞中Cyclin D1表达，见图1。

　　2.4 OP对MCF7乳腺癌细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA表达的影响

　　8μmol/L OP能促进MCF7乳腺癌细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA表达，高浓度(16μmol/L)OP则抑制细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA表达，见表3。表3 OP对MCF7乳腺癌细胞中CDK2、CDK4、 Cyclin D1 mRNA表达的影响 (对数值)

　　3 讨论

　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生命。在过去50年中，乳腺癌发病率增加了2倍，1940年以来，美国的乳腺癌发病率每年递增1%。乳腺癌的发病与遗传、生殖、雌激素、营养、电离辐射等多种因素有关。环境雌激素是指能够模拟或干扰机体内源性雌激素的合成、分泌、转运、结合、排泄、生理作用等一类外源性化学物质。辛基酚是一种具有雌激素活性的化工原料，主要用于生产非离子表面活性剂、增塑剂、热稳定剂等，广泛存在于生活、工作环境的水体、淤泥、土壤和食品如鱼类、贝类、饮水及饮料中 [3]。OP具有生殖、发育毒性，青春期前大鼠较长期接触OP会引起成年大鼠精子细胞凋亡，降低雄性生育能力[4]，增加激素依赖性肿瘤发病 [5]。本研究发现低浓度(4、8μmol/L)的OP能促进MCF7乳腺癌细胞的增殖，高浓度 (16mol/L) 的OP抑制MCF7乳腺癌细胞的增殖。这与以前报道的低浓度(4、8μmol/L)的OP能抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖不一致[2]，这可能与所采用的乳腺癌细胞株不同有关，与前人研究结果相一致[1]。

　　细胞增殖依赖于细胞周期的顺利进行，细胞经有丝分裂，将细胞一分为二，该过程受G1/S、G2/M两个关健点调控。研究发现OP通过下调Bcl2和 Caspase3表达，诱导Sertoli细胞[6]和MDAMB231乳腺癌细胞凋亡。本研究发现低浓度OP对细胞周期相没有明显影响，高浓度OP将细胞阻滞于G0/G1期，细胞凋亡明显增加，这与植物雌激素三羟异黄酮将MCF7乳腺癌细胞阻滞于G2/M不一样。

　　细胞周期的正常进行与细胞周期调控蛋白和细胞周期依赖性激酶的正常表达密切相关。Cyclin DCDK是G0/G1期的限速步骤。当生长信号传到细胞周期调控时，Cyclin D转录速度加快，使Cyclin D表达增加量和稳定性增加。Cyclin D激活CDK4，释放出E2F，驱动细胞周期的进行。过度表达Cyclin D能加速细胞通过G1期，使细胞增殖加速。Koroxenidou等[7]发现17羟雌二醇通过减少CDK2、CDK4的表达及降低CDK2的活性，将细胞阻滞于G1/S期。本研究发现高浓度的OP作用MCF7乳腺癌细胞，能下调CDK2、CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达，降低Cyclin D1蛋白的表达，将细胞阻滞于G1/S期，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，OP表现细胞毒性。低浓度OP通过上调CDK2、CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达，细胞周期加速，促进细胞增殖，OP表现雌激素活性。

　　【参考文献】

　　[1] Han D,Tachibana H,Yamada K.Inhibition of environmental estrogeninduced proliferation of human breast carcinoma MCF7 cells by flavonoids [J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2001,37(5):275282.

　　[2] 彭俊华，张峰，张华欣，等.辛基酚对MDAMB231乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响[J].第四军医大学学报，2006,27(24):22392241.

　　[3] 彭俊华，张峰.辛基酚对机体健康的影响及其机理的研究进展[J]. 西北国防医学杂志，2004,25(6):445446.

　　[4] Kim SK,Lee HJ,Yang H,et al. Prepubertal exposure to 4tertoctylphenol induces apoptosis of testicular germ cells in adult rat [J].Arch Androl，2004,50(6):427441.

　　[5] Yoshida M,Katsuda S,Tanimoto T,et al.Induction of different types of uterine adenocarcinomas in Donryu rats due to neonatal exposure to highdose octylphenol for different periods [J].Carcinogenesis，2002,23(10):17451750.

　　[6] Qian J,Bian Q,Cui L, et al.Octylphenol induces apoptosis in cultured rat Sertoli cells [J].Toxicol Lett，2006,166(2):178186.

　　[7] Koroxenidou L,Ohlson LC,Porsch HI.Longterm 17 alphaethinyl estradiol treatment decreases cyclin E and cdk2 expression,reduces cdk2 kinase activity and inhibits S phase entry in regenerating rat liver [J].J Hepatol,2005,43(3):478484.