白细胞介素15及其受体在儿童急性白血病中的表达和作用探讨

    作者：叶中绿，陈铭珍，陈日玲，黄秀兰，庞伟君，陈水文    作者单位：广东湛江，广东医学院附属医院儿科，2.检验科；3.深圳市保安区妇幼保健院儿科     【摘要】  目的 探讨IL15水平及其受体在儿童急性白血病中的表达及作用。方法 取确诊未治的儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）、儿童急性非淋巴细胞白血病（ANLL）和非白血病组儿童各20例，20例正常儿童的血清，测定不同组别对象血清IL15的水平和不同组别对象的骨髓单个核细胞IL15受体三个亚基α、β、γ的表达并进行半定量分析。结果 急性白血病患儿血清IL15水平较正常和对照组均出现明显下降；IL15受体α、β、γ亚基的表达水平也均较正常组和对照组明显下降，但ALL与ANLL组之间和非白血病组与对照组之间差异无统计学意义。结论 急性白血病患儿无论血清IL15水平及其骨髓单个核细胞IL15受体α、β、γ均出现下降。

    【关键词】  急性白血病；白细胞介素15；受体；基因

    Levels of Interleukin15 and Its Receptor Subunit Expression in Children Acute Leukemia

    YE Zhonglv1, CHEN Mingzhen1, CHEN Riling1,HUANG Xiulan1,PANG Weijun2, CHEN Shuiwen3

    1.Department of  Pediatrics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,China;2.Department of Laboratory；3.Maternal and Child Health Hospital, BaoAn District, Shen zhen

    Corresponding Author：CHEN Mingzhen, Email: Chenminzhen @tom.comAbstract：Objective   To investigate the expression of IL15 and its receptor in children acute leukemia, contribute to understand their function on acute leukemia. Methods  Every group of acute lymphocytic leukemia(ALL),acute myeloid leukemia (ANLL) or nonleukemia group had 20 children who did not receive any treatment. The expression of the interleukin15 receptor alpha,beta,gamma mRNA in bone marrow were examined by RTPCR, and make an Semiquantitative analysis. The level of IL15 in serum of every group by means of ELISA.Results  The level of IL15 in AL（ALL and ANLL）group， were significant was assayed in statistics（P<0.05）with healthy children and nonleukemia group .The difference which the IL15 level of  ALL compared with ANLL or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglected in statistics（P>0.05）.The expression of IL15R alpha，beta，gamma  mRNA in AL is significantly different than that of healthy and nonleukemia children.The difference which the IL15 alpha，beta，gamma of ALL compared with ANLL or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglectable in statistics （P>0.05）. Conclusion  The IL15 level of AL children is lower than control group.And the expression that of IL15Rα,β,γ subunit in bone marrow mononuclear cell of AL is smaller than those of  nonleukemia group.

    Key words：Acute leukemia; Interleukin15;  Receptor；Gene

    免疫因素在白血病的发生发展中起着重要的作用，尤其是细胞免疫功能的变化，可能与白血病的发生密切相关；白细胞介素15(IL15)是一种可溶性的淋巴细胞生长因子。我们既往的研究发现，一定浓度的IL15对骨髓增生异常综合征(MDS) CD34＋造血细胞有刺激增殖分化和抑制凋亡的效果，其机制可能是与IL15上调bcl2、bclXL凋亡抑制基因和Caspase3的表达有关[14]。最近，我们通过检测部分白血病患儿及其健康儿童的血清IL15水平及其受体表达情况，探讨它们在儿童急性白血病中的表达及作用，现报告如下。

    1  资料和方法

    1.1  临床资料

    所有标本分别来自本院新确诊的病例和健康体检的儿童，均未经过任何细胞因子、激素或化学药物的治疗。分组：急性白血病组患儿40例，年龄4～16岁，其中男26例，女14例；包括急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿20例，男12例、女8例；急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患儿20例，男14例、女6例；诊断标准按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》第二版[5]。非白血病组患儿20例，男13例，女7例，年龄在2～13岁，其中缺铁性贫血患儿10例、巨幼细胞性贫血患儿4例、葡萄糖6磷酸脱氢酶 (G6PD) 缺乏症缺乏患儿3例和地中海贫血的患儿3例。正常儿童对照组20例，年龄在4～10岁之间，其中男10例，女10例。

    1.2  方法

    1.2.1  标本采集

    抽取不同组别对象的外周血5ml，用离心机2 000g/min，离心5min，吸取血清转移到另一管，-20℃保存待测。同时抽取骨髓5～10ml，置含肝素的抗凝管中，充分混匀，即时分离单个核细胞，操作过程注意无菌。

    1.2.2  IL15测定

    分离好的血清在常温下解冻20min，从4℃冰箱取出IL15 ELISA试剂盒在室温下放置20min，平衡至室温。其余的操作按试剂盒说明进行。

    1.2.3  PBMC分离、总RNA的提取、目的基因RTPCR扩增

    （1）引物设计与合成

    IL15受体α、β、γ亚基基因的mRNA从GenBank中找出，引物根据Primer软件设计，由上海生工生物工程技术服务合成。引物序列为：βactin：(528bp)上游5′ CTACAATGAGCTGCGTGTGG 3′，下游5′ AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3′；IL15Rα：(203bp)上游5′ CACCTATG AAA CTCGGGGAAAC 3′，下游 5′ ATGGGAATGCGGAG AA CC 3′，IL15Rβ：(236bp)上游5′ GTGCGATGGAGGGTGATG  3′，下游5′ CATTCCTGCTTCTGCTTGAG  3′，IL15Rγ: (428bp) 上游5′ CATTGGAAGCCGTGGTTATC 3′,下游5′ GGTGAGTATGAGACGCAGGTG  3′。

    （2）RTPCR

    按QIAGEN公司的RTPCR一步法试剂盒说明书操作。其具体步骤为：先加入标本和试剂（冰上进行），然后于PCR仪上进行扩增，参数及条件如下：50℃ 30min,反应条件为94℃，预变性15min，34个循环：94℃变性45 s；50℃～68℃退火30 s；72℃延伸45 s；最后72℃延伸10min，总反应体积为25μl。其中α亚基的退火温度为53℃，β亚基的退火温度为53℃，γ亚基的退火温度为54℃，βactin的退火温度为55℃。α亚基的循环次数为31次，β亚基的循环次数为35次，γ亚基的循环次数为35次，βactin的循环次数为31次。

    1.2.4  电泳和图像分析

    取目的基因产物和内参产物混匀，于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果，并拍照图片，图片经扫描仪扫描后，用SigmaScan 5.0图像分析软件进行光密度积分值分析，分别计算出检测基因与βactin (内参)的光密度值之比，作为其相对含量值。

    1.3  统计学方法

    计量资料用±s表示，使用SPSS11.５统计软件进行统计分析，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

    2  结果

    2.1  白细胞介素15的水平

    不同组别血清中白细胞介素15的水平检测，急性淋巴细胞白血病组的IL15浓度为（34.37±2.8）pg/ml，急性非淋巴细胞白血病组的浓度为（29.61±3.2）pg/ml，正常对照组的浓度为（122.23±4.2）pg/ml，非白血病组的浓度为（117.54±3.9）pg/ml；其中ALL、ANLL组IL15的浓度分别和正常对照组的浓度进行比较，P均<0.05，差异有统计学意义。ALL、ANLL组IL15的浓度分别和非白血病组的浓度进行比较，P均<0.05，差异有统计学意义。ALL和ANLL组比较、正常对照组和非白血病组比较，P均>0.05，差异无统计学意义，见表1。表1  不同组别外周血清中IL15浓度

    2.2  不同组别的骨髓单个核细胞的IL15受体α亚基基因表达

    IL15受体α亚基条带在非白血病组最清晰，ALL组、ANLL组、非白血病组的表达率分别是75％、75％、100％，α亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.4618±0.1460、0.4952±0.1271、0.8964±0.2130。ALL组、ANLL组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较，P均<0.05，有显著性差异。而且ALL组灰度扫描结果的比值与ANLL组的比值进行比较，P>0.05，差异无统计学意义，见图1。

    2.3  不同组别的骨髓单个核细胞的IL15受体β亚基基因表达

    IL15受体β亚基条带在非白血病组最清晰，ALL组、ANLL组、非白血病组的表达率分别是80％、85％、100％，β亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5391±0.1740、0.5514±0.1961、0.8846±0.1310。ALL组、ANLL组的灰度扫描结果比值分别和非白血病组的比值进行比较，P均<0 .05，差异有统计学意义。而且ALL组灰度扫描结果的比值与ANLL组的比值进行比较，P>0.05，差异无统计学意义，见图2。

    2.4  不同组别的骨髓单个核细胞的IL15受体γ亚基基因表达

    IL15受体γ亚基条带在非白血病组最清晰，ALL组、ANLL组、非白血病组的表达率分别是80％、80％、100％，γ亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5104±0.1245、0.4997±0.1072、0.9062±0.2013。用ALL组、ANLL组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较，P均<0.05，有显著性差异。而且用ALL组灰度扫描结果的比值与ANLL组的比值进行比较，P>0.05，差异无统计学意义，见图3。

    3  讨论

    通过检测IL15水平，结果ALL组、ANLL组血清IL15的水平均较非白血病组和正常对照组低，但ALL和ANLL的血清IL15水平差异无统计学意义，说明IL15在急性白血病患儿中的表达水平要比正常儿童的低。由于IL15具有一定的免疫介导作用，其水平下降，可能是导致急性白血病患儿免疫功能低下的原因之一，郭承吉等 [6]发现IL2也存在类似现象。由于IL15和IL2有着广泛的同源性；是否急性白血病血清IL15的水平也与病情及预后相关，而通过调节或刺激体内的细胞因子水平，是否可以达到一定的抗肿瘤作用[7]？因此，对白血病患儿的IL15水平进行动态观察，可能有助于观察AL的病情发展，判断预后及预测复发。

    在ATL疾病，人类T细胞白血病病毒Ⅰ（HTLVⅠ）感染的细胞其IL15RαmRNA表达显著升高，而且HTLVⅠTax蛋白的表达可进一步使IL15RαmRNA水平升高，表明IL15Rα在ATL细胞增殖中有一定的作用[8]。也有发现IL15R高表达的白血病患儿其预后较好，生存期长，目前机制未明[9]；本课题用RTPCR方法从分子水平上检测骨髓中单个核细胞IL15R亚基mRNA的表达，检测显示：ALL组、ANLL组、非白血病组IL15受体α亚基mRNA的表达率分别是75％、75％、100％；β亚基mRNA的表达率分别是80％、85％、100%；γ亚基mRNA的表达率分别是80％、80％、100%，其中α亚基在BMMC的表达率未见有文献报道；β亚基表达率较文献[10]报道偏高，与文献[11]结果相似；而γ亚基的表达率和文献[11]报道基本一致。而且在ALL组、ANLL组中IL15R三个亚基mRNA的表达水平均比非白血病组低，说明急性白血病IL15 受体三个亚基无论是表达率还是表达水平均要低于非白血病组。

    在白血病中,除少数类型白血病细胞外,人们检测到大多数白血病细胞有Fas 的高表达[12] , Fas/FasL 系统作为诱导细胞凋亡的一条重要途径,也参与了白血病的发病过程。并且发现Fas的表达与白血病的病情进展、治疗效果及预后密切相关。已有研究表明IL15不仅能阻止自发的凋亡而且能够阻止Fas引起的死亡信号介导的广泛凋亡[13]；而且Bcl2 家族通过调节某些细胞中的Fas 介导凋亡,尤其是Bcl2 基因的上调,能对一些肿瘤提供Fas 抗性[14] ,对白血病细胞的作用则是阻止分化细胞凋亡。因此，IL15R在急性白血病的发生发展中是否起到一定的作用，从而在一定程度上导致AL发生的问题值得进一步探讨。

【参考文献】[1]程涵蓉，陈铭珍，陈日玲，等.IL15对MDS造血前体细胞凋亡的影响[J].中国小儿血液，2003，8(5)：207209.

[2] 叶中绿，陈铭珍，陈日玲，等.白细胞介素15对骨髓增生异常综合征骨髓造血干/祖细胞增殖的影响[J].临床血液学杂志，2004，17（3）：157159.

[3] 程涵蓉，陈铭珍.白细胞介素15抑制骨髓增生异常综合征患儿骨髓造血前体细胞凋亡的研究[J].中华儿科杂志,2004，42（11）：859859.

[4] 叶中绿，陈铭珍，陈日玲，等.IL15对MDSCD34+细胞增殖分化的作用探讨[J].细胞与分子免疫学杂志，2005，21（1）：106109.

[5] 张之南.血液病诊断及疗效标准[M].第2版.北京：科学出版社，1998.171193.

[6] 郭承吉，张瑞英，曹艳英，等. 小儿急性白血病患者外周血IL2活性及sIL2R表达水平的测定[J].中国医科大学学报，1996，25（3）：330331.

[7] 刘承利，臧晓霞，窦科峰,等.转41 BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究[J].肿瘤防治研究，2007，34（2）:115117.

[8] Dubois S,Magrangeas F,Lehours P,et al. Nature splicing of exon 2 of human interleukin15 receptor αchain mRNA results in ashortened from with a distinct pattern of expression[J]. J Biol Chem,1999,274(38):2697826984.

[9] Giri JG,Kumaki S,Ahdieh M,et al.Identification and cloning of a novel IL15 binging protein that is structurally related to the alpha chain IL2 receptor [J].EMBO,1995,14（15）:36543663.

[10]Wu S, Gessner R, von Stackelberg A, et al. Cytokine/cytokine receptor gene expression in childhood acute lymphoblastic leukemia [J]. Cancer，2005,103(5):10541063.

[11]Fehniger TA, Suzuki K, VanDeusen JB, et al. Fatal leukemia in interleukin15 transgenic mice[J].Blood Cells Mol Dis,2001,27(1):223230.

[12]De Fanis U ,Dalla Mora L ,Romano C,et al. Altered constitutive and activation induced expression of CD95 by Band Tcells in Bcell chronic lymphocytic leukemia [J]. Haematol,2002,87 (3):325327.

[13]Tinhofer I, Marschitz I, Henn T, et al. Expression of functional interleukin15 receptor and autocrine production of interleukin15 as mechanisms of tumor propagation in multiple myeloma[J].Blood, 2000,95(2):610618.

[14]Lanvin O,Guglielmi P,Fuentes V,et al. TGF2beta1 modulates Fas (APO1/CD95)mediated apoptosis of human preB cell lines[J]. Eur J Immunol,2003, 33(5):13721381.