人参皂苷Rh2对荷肺癌小鼠基因表达的肿瘤特异性调节

    作者：张文静，包丽华，俞春莺，张军毅，赵 安,许长江,贾韦国    作者单位：上海中药创新研究中心     【摘要】  目的 研究人参皂苷Rh2对正常和荷肺癌小鼠基因表达的调节差异。方法 运用寡核苷酸芯片技术，检测Rh2对正常和荷瘤小鼠的基因表达调节，并对差异基因进行聚类和统计分析。为了进一步验证芯片结果，我们使用实时荧光定量PCR方法检验Rh2对基因表达的作用效果。结果 与正常小鼠相比，Rh2对荷瘤小鼠的基因表达影响更大，二者的主要受调脏器也不同；Rh2对正常和肿瘤小鼠基因表达调节没有明显的相关性；Rh2能有效拮抗局部接种肿瘤引起的荷瘤小鼠各脏器基因异常表达。结论 Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节具有肿瘤特异性。

    【关键词】  人参皂苷Rh2；基因芯片；基因表达谱

    Tumor Specific Gene Regulation by Ginseng Saponin Rh2 in Mice Bearing Lung Cancer

    ZHANG Wenjing, BAO Lihua, YU Chunying, ZHANG Junyi, ZHAO An, XU Changjiang, JIA Weiguo

    Shanghai Innovative Research Center of TCM,Shanghai 201203,China

    Corresponding  Author: JIA Weiguo,Email:wjia@interchange.ubc.caAbstract：Objective   To study gene differential expression profiles by ginsenoside Rh2 in normal and tumorbearing mice.Methods  Gene expression profiles after treatment with Rh2 in normal and tumorbearing mice were determined by Oligo chip technology as well as the clustering and statistic analysis of single gene.To further validate the microarray results,we used quantitative realtime RTPCR to examine the effect of Rh2 on individual genes.Results  As compared with normal mice, treatment with Rh2 changed gene expression more potently in mice bearing tumor.Theres no obvious correlation on the gene expression profiles between the normal and tumorbearing mice.Treatment with Rh2 was found to be effectively resistant abnormal gene expression profiles in some major organs that resulted from the local implantation of tumor.Conclusion  The data showed that there is specific regulation of gene expression profiles related to tumor by Rh2 in mice bearing tumor.

    Key words：Rh2; Oligo chip assay; Gene expression profile人参(Panax ginseng C.A. meyer)为五加科多年生草本植物，是有几千年应用历史的名贵中药。其效果不仅早为古今中外无数医学家肯定，而且为现代科学研究所证明。最早对人参药理功用给予高度评价的，首推《神农本草经》。书中明确指出，人参“主补五脏，安精神，止惊悸，除邪气，明目，开心益智”。

    人参主要含有皂苷、人参多糖、多肽类、氨基酸及维生素等物质。人参皂苷是人参中主要的活性有效成分，主要包括原人参二醇组和原人参三醇组。人参皂苷的生理活性，决定了它的食用和药用价值。大量研究结果表明，人参皂苷具有抗疲劳[1，2]、提高记忆、延缓衰老[3，4]、提高机体免疫功能[5]及抗肿瘤等多种作用。尤其值得一提的是人参皂苷的抗肿瘤功效。实验证明，人参提取物可以预防治疗食管癌、胃癌、肺癌、肝癌等多种癌症[6]。特别是原人参二醇组皂苷Rh2，研究发现其有较强的抑制肿瘤细胞生长作用[7]。

    基因芯片技术被广泛应用于基因表达及调控的研究，生物体（组织）在不同的时间条件下有不同功能基因表达，通过从样品中提取RNA再反转录成cDNA，与含有代表该生物体（或组织）中所有功能基因的芯片进行杂交，就可得到该样品中功能基因的表达情况。例如，人类基因组中大约编码100000个不同的基因，通过DNA芯片技术进行检测，只需一次就几乎可以获得全部的表达情况。

    本文运用基因芯片技术研究了口服人参皂苷Rh2对正常和荷瘤小鼠的基因调节作用。试验结果表明：与正常小鼠相比，Rh2对荷瘤小鼠的基因表达影响更大，二者的主要受调脏器也不同；Rh2处理后正常和荷瘤小鼠各脏器的基因表达谱之间没有明显的相关性；Rh2能有效拮抗因肿瘤引起的荷瘤小鼠各脏器基因异常表达，表明Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节具有肿瘤特异性。

    1  材料与方法

    1.1  试验动物C57BL/6小鼠，雌性，18～20g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

    1.2  主要试剂

    Trizol试剂盒（Invitrogen）；Rneasy Mini 试剂盒（QIAGEN）；20×SSPE洗液（Invitrogen）；20 % N月桂酰肌氨酸溶液NLauroylsarcosine Solution (SIGMA); 逆转录酶MMLVRT（Promega）；寡核苷酸混合物dNTP Mix(ATP、GTP、CTP、UTP)（Amersham）；aaUTP（Ambion）；溴化钠Sodium bricarbonate（SIGMA）；羟胺Hydroxylamine（SIGMA）；Cy3 NHS easter 及 Cy5 NHS easter（Amersham）；稳定和干燥溶液Stabilization and Drying Solution（Agilent）；小鼠寡核苷酸芯片Mouse oligo microarray（Agilent）

    1.3  主要仪器

    Agilent扫描仪，Chrom4 荧光定量PCR仪。

    1.4  方法

    1.4.1  小鼠肿瘤模型及取材

    总共80个小鼠随机分成四组，每组20只，其中两组为荷瘤小鼠, 于右腋皮下接种0.2ml 共8×106Lewis肺癌（3LL）细胞悬液。两组正常小鼠(非荷瘤小鼠)分别以溶剂0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）灌胃，作为阴性对照组（简称为NS组），以100mg/（kg·d） Rh2（用0.5%CMCNa溶液配成4mg/ml溶液）灌胃,简称为NR组；荷瘤小鼠以溶剂0.5% CMCNa灌胃，简称TS组；以上述同样剂量的Rh2灌胃, 简称为TR组。接种肿瘤24h后开始灌胃，每日一次连续21天。试验结束后，分别取各小鼠的大脑、心、肺、肝、脾、胸腺和肿瘤组织，其中10只小鼠的各个脏器匀浆后分别提取RNA，得到的RNA等量同组混合，经反转录为cDNA后，用于芯片检测。

    1.4.2  芯片检测

    (1)总RNA抽提及纯化  应用Trizol 试剂盒提取RNA。测定OD260和OD280值，鉴定核酸纯度；使用RNeasy Kit纯化总RNA。

    (2)cDNA合成  取2μg总RNA，5μl 0.1μg/μl T7 promoter primer，用水补足体积至11.5μl，65℃保温10min，冰浴5min，在该体系中加入4μl 5×First Strand Buffer，2μl 0.1M DTT，1μl 10mM dNTP，1μl MMLVRT，0.5μl RNase OUT，40℃保温2h。

    (3)荧光标记cDNA合成、纯化  将合成的cDNA在65℃保温15min，冰浴5min。加入Transcription mix（含有5.7μl Rnasefree Water，20μl 4×Transcription Buffer，6μl 0.1M DTT，16μl dNTP Mix(dATP,dGTP,dCTP,dUTP)，6.4μl 50% PEG，0.5μl Rnase OUT，0.6μl Inorganic Pyrophosphatase，4μl 25mM aaUTP，0.8μl T7 RNA Polymerase并混匀，40℃保温2h，随后置于冰上。按照RNeasy Mini Protocol进行cDNA纯化。

    (4)cDNA探针后标记，cDNA探针纯化  取4μg cDNA,并浓缩至6.6μl，加入10 μl DMSO(Sigma)，混匀，加入3.4μl 0.3M sodium bicarbonate buffer（pH 9.0），混匀。将上述20μl cDNA混合物加入到荧光染料中并混匀，放置室温1h，加入9μl 4M Hydroxylamine，混匀，放置室温15min。按照RNeasy Mini Protocol进行cDNA探针纯化。

    (5)cDNA探针定量  Cy3探针浓度（pmol/μl）=A552/0.15，Cy5探针浓度（pmol/μl）=A650/0.25。

    (6)芯片杂交  对DNA进行片段化(100pmol Cy3 cDNA,50pmol Cy5 cDNA, 50μl 10× control target，加入RNasefree Water补充体积至240μl),在其中加入10μl Fragmentation Buffer, 轻轻混匀，60℃保温30min（不超过30min），加入250μl Hybridization Buffer，轻轻混匀，取490μl杂交溶滴加在盖玻片上，盖上芯片并密封芯片于杂交盒中，60℃滚动杂交16h。

    (7)芯片洗涤  将芯片放入洗液1(700ml DEPCH2O, 300ml 20×SSPE, 0.25ml 20%NLauroylsarcosine)中洗涤1min，将芯片放入洗液2中(997ml DEPCH2O, 3ml 20×SSPE, 0.25ml 20%NLauroylsarcosine)洗涤1min，将芯片放入洗液3中(Stabilization and Drying Solution)洗涤30s。

    (8)芯片扫描以及数据分析  使用Agilent Scanner 来获取图像。扫描像素值：10μm，PMT(%)数值：100，图像通常是16bit tiff文件。图像直接使用Agilent系统相应的图像分析软件Feature Extraction进行定量分析处理。一般认为ratio值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。

    1.4.3  Realtime PCR

    按照SYBR Green 试剂盒(BioRad)进行Realtime PCR 实验,所用仪器为MJ Research生产的Chrom4 Real－time PCR仪。βactin 用作内标，扩增小鼠βactin 的引物为GCTAC AGCTT CACCA CCACA 3/5CATCG TACTC CTGCT TGCTG 3。

    扩增小鼠Ifi202b、Cidea、Cdk8、MMP9、Calm4 的引物分别为5GGTGTGG GATAAAG AACAGCA 3/5TCAAT GCCAC CACTT GTTTG 3、5 GCCTG CAGGA ACTTA TCAGC 3/5TGCTT GCAGA CTGGG ACATA 3、5 GATTC CCTCA ACAAC CCAGA 3/5 CGGCT TTCCT TCATT CTGTT 3、5 GTGGG TGTAC ACAGG CAAGA 3/5 ACTCC TTATC CACGC GAATG 3、5 TGATG GCAAG ATCAG CTTTG 3/5 CACGG ATCAT GTCCT CCAG 3。

    cDNA 制备同“芯片检测”方法中描述。PCR反应在20μl体系中完成，包括：10μl iQTM SYBR Green Supermix (Biorad), 0.1μl cDNA, 0.3μm相应引物。PCR反应条件为：94℃解链30s;40个循环（94℃解链30s，55℃退火30s，72℃延伸30s）；72℃延伸10min。在每个循环的延伸步骤之后采集荧光信号，运用ΔΔCT法计算结果。

    2  结果

    2.1  Rh2对正常小鼠若干脏器组织中基因的表达调节

    应用Agilent小鼠全基因寡核苷酸芯片（芯片产品目录号：G4121A，60 mer Oligo Microarray，共有20 868个基因信息）检测Rh2对正常小鼠各脏器组织的基因表达调节。以NS组为对照组，NR组为实验组检测，以期了解Rh2对正常组织器官基因的潜在调节作用。

    Rh2对正常小鼠各脏器的基因表达影响较小，表现在其调节各脏器的差异基因数较少。其对正常小鼠基因的表达调节主要集中在脾脏和肺，同时其对大脑、心脏、胸腺、肝中的基因也有一定调节，见图1。

    2.2  皮下局部移植性肿瘤对正常小鼠若干脏器组织的基因表达调节

    运用Agilent小鼠全基因寡核苷酸芯片检测皮下局部移植性肿瘤对正常动物的基因表达调节。以NS组为对照组，TS组为实验组检测。

    左图为大脑、心脏、肺、胸腺、肝、脾各脏器中上调和下调的基因数

    右图为各个脏器中差异基因数占所有脏器差异基因数的百分比

    图1  Rh2对正常小鼠的基因表达调节

    皮下移植生长的肿瘤作为一个局部的病灶能很大程度地影响动物各脏器的基因表达，对于机体的主要功能器官心脏、肺、肝及免疫器官胸腺和脾脏的基因表达都有很大程度的影响，同时对于控制神经功能的大脑的基因表达也有调节，见图2。上述结果说明一个局部的肿瘤病灶对整体远端的各个器官的基因表达都有显著影响, 从而说明局部的病灶可能扰乱整体的正常功能，这与传统中医用整体的观念来治疗局部疾病的指导思想具有一致性。

    2.3  Rh2对荷瘤小鼠若干脏器组织中基因的表达调节

    运用Agilent小鼠全基因寡核苷酸芯片检测Rh2对荷瘤小鼠若干脏器组织的基因表达调节。以TS组为对照组，TR组为实验组检测，以期了解Rh2对荷瘤小鼠各组织器官基因的影响。

    Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节与其对正常小鼠的基因表达调节有很大差异，一是调节的基因数量大为增加，二是主要调节的脏器有所不同。Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节主要发生在心脏，胸腺及大脑，同时其对肺、肝、脾，见图3。由此可见Rh2明显改变了荷瘤小鼠大脑和心脏的基因表达，而对正常小鼠的大脑和心脏没有很大影响。

    2.4  由芯片数据分析比较Rh2对正常小鼠和荷瘤小鼠各脏器基因表达调节的相关性  正常小鼠各脏器基因表达的调节是不同的，见表1。在荷瘤小鼠被Rh2上调的基因中只有1.45%在正常小鼠中亦被Rh2上调。正常和荷瘤小鼠中同时被Rh2下调的基因也只占Rh2下调荷瘤小鼠基因的2.44%。说明对正常小鼠和荷瘤小鼠Rh2所调节的基因没有明显的相关性。提示Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节具有肿瘤依赖性。表1  比较Rh2对荷瘤动物和对正常动物基因表达调节的相关性（NR/NS vs TR/TS）

    2.5  由芯片数据分析比较Rh2治疗前后荷瘤小鼠(TR/TS)以及皮下接种肿瘤后小鼠(TS/NS)各脏器的基因表达调节的相关性

    Rh2治疗前后的荷瘤小鼠各脏器基因表达变化情况与皮下接种肿瘤后小鼠各脏器基因表达变化情况进行比较(TR/TS vs TS/NS，见表2，我们发现Rh2对于荷瘤小鼠的大脑和胸腺的基因调节与局部接种肿瘤导致的基因调节有很大的相关性。Rh2具有明显回复调节因接种肿瘤导致大脑和胸腺组织基因表达异常。在胸腺中有29.85%因肿瘤下调的基因在Rh2治疗后上调；在胸腺中有18.60%因肿瘤上调的基因在Rh2治疗后下调。有趣的是, Rh2在大脑中对于受肿瘤影响而上调的基因具有比较显著的作用, 但是Rh2对大脑受肿瘤影响而下调的基因似乎作用不大, 表现在有29.13%因肿瘤上调的基因在Rh2治疗后下调, 仅有2.25%的被肿瘤下调的基因因为Rh2而趋于恢复。这些基因的调节变化可能与Rh2的治疗有相应的关系，Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节极具肿瘤特异性。表2  比较Rh2对荷瘤小鼠和肿瘤对正常小鼠基因表达调节的相关性

    2.6  Rh2治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织的基因表达

    对Rh2治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织的基因表达的基因芯片检测发现Rh2使得肿瘤组织中的48个基因得到上调，105个基因得到下调。在这些上调的基因中包括了具有抑制转录调节因子与抑制细胞增殖功能的基因和凋亡诱导基因, 而在下调的基因中则包括了细胞周期的调节基因和与细胞转移相关的基因。上述研究结果表明Rh2在肿瘤组织中通过调节与肿瘤细胞生长、凋亡以及转移相关的基因在一定程度上抑制了肿瘤的生长和转移。

    2.7  用Real time PCR技术验证Rh2治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织的基因表达差异

    运用SYBR Green实时PCR相对定量技术，以Actin为内参基因，对芯片检测到的肿瘤生长相关基因进行RNA表达水平的检测。运用ΔΔCT法计算结果，见表3，可以看到在治疗21天的肿瘤组织中Ifi202b上调了65.8倍，Cidea上调了15.3倍，Cdk8下调了约6倍，MMP9下调了约5倍。可见实时荧光定量PCR实验结果与芯片结果保持高度一致性。表3  用芯片技术检测Rh2治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织的 基因表达差异，并由Real time PCR技术进行验证

    3  讨论

    综合以上结果，我们可以看到Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节极具肿瘤特异性：首先Rh2对正常小鼠各脏器的基因表达影响较小，受调基因数较少，调节主要集中在脾脏和肺，而Rh2对荷瘤小鼠的各脏器的基因表达影响相对较多，受调基因数大为增加，调节的脏器主要集中在心脏、胸腺及大脑；其次Rh2对荷瘤小鼠和正常小鼠各脏器的基因表达调节是不同的，只有4%的基因相同；再次，在胸腺和大脑中相当多因肿瘤生长而异常表达的基因得到有效拮抗；最后，荷瘤小鼠经Rh2治疗后，肿瘤组织中相当多基因的表达受到调控，作用原理在于抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、影响肿瘤转移等。所以，Rh2对荷瘤小鼠的基因表达调节极具肿瘤特异性。Rh2对正常器官的基因表达的微小影响, 解释了人参皂苷多年来所显示的无毒副作用的临床观察。而局部肿瘤种植所引起的机体各脏器基因表达的显著改变, 也许是肿瘤细胞或者肿瘤周围组织及机体免疫系统所释放的众多因子的作用, 而Rh2对这些由于肿瘤而导致的各脏器(尤其是脑、 心脏和胸腺)基因表达异常的恢复作用, 验证了传统中医在人参的临床使用中扶邪归正的功能。

【参考文献】［1］ Masuno H,Kitao T,Okuda H.Ginsenosides increase secretion of lipoprotein lipase by 3T3L1 adipocytes[J].Biosci Biotech Biochem,1996,60(12):19621965.

［2］ Kim HS, Lee JH, Goo YS,et al.Effects of ginsenosides on Ca2+ channels and membrane capacitance in rat adrenal chromaffin cells[J].Brain Res Bull,1998,46(3):245251.

［3］ MookJung I,Hong H S,Boo J H.et al.Ginsenoside Rb1 and Rg1 improve spatial learning and increase hippocampal synaptophysin level in mice[J].J Neurosci Res,2001,63(6):509515.

［4］ Rudakewich M,Ba F,Benishin CG.Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb(1) and Rg(1)[J].Planta Med,2001,67(6):533537.

［5］ Berek L,Szabo D,Petri I B.Effects of naturally occurring glucosides, solasodine glucosides,ginsenosides and parishin derivatives on multidrug resistance of lymphoma cells and leukocyte functions[J].In vivo,2001,15(2):151156.

［6］ Yun TK,Choi SY.Preventive effect of ginseng intake against various human cancers:a casecontrol study on 1987 pairs[J].Can Epidemiol Biomarkers Prev,1995,4（4）:401408.

［7］ Lee KY,Park JA,Chung E,et al.GinsenosideRh2 blocks the cell cycle of SKHEP1 cells at the G1/S boundary by selectively inducing the protein expression of p27kip1[J].Cancer Lett,1996,110（12）:193200.

［8］ Min W,Ghosh S,Lengyel P.The interferoninducible p202 protein as a modulator of transcription: inhibition of NFkappa B,cFos,and cJun activities[J].Mol Cell Biol,1996,16(1):359368.

［9］ Choubey D,Gutterman JU.The interferoninducible growthinhibitory p202 protein:DNA binding properties and identification of a DNA binding domain[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,221(2):396401.

［10］Choubey D,Gutterman JU.Inhibition of E2F4/DP1stimulated transcription by p202[J].Oncogene,1997,15(3):291301.

［11］Choubey D,Lengyel P.Binding of an interferoninducible protein (p202) to the retinoblastoma protein[J].J Biol Chem,1995,270(11):61346140.

［12］Xin H,Pramanik R,Choubey D.Retinoblastoma (Rb) protein upregulates expression of the Ifi202 gene encoding an interferoninducible negative regulator of cell growth[J].Oncogene,2003,22(31):47754785.

［13］Nohara N,Koseki T,Chen S,et al.CIDE,a novel family of cell death activators with homology to the 45 kDa subunit of the DNA fragmentation factor[J].EMBO J,1998,17(9):25262533.

［14］Liang L，Zhao M，Xu Z,et al.Molecular cloning and characterization of CIDE3,a novel member of the celldeathinducing DNAfragmentationfactor (DFF45)like effector family[J].Biochem J,2003,370（pt1）:195203.

［15］Bayascas JR,Yuste VJ,Sole C,et al. Characterization of splice variants of human caspaseactivated DNase with CIDEN structure and function[J].FEBS Lett,2004,566(13):234240.