人Ⅰ期肺腺癌及癌旁组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析

    作者：刘桂芝，吴逸明    作者单位：1. 郑州大学第一附属医院体检科；2.郑州大学公共卫生学院劳动卫生与毒理学教研室     【摘要】  目的 筛选并鉴定存在明显表达差异的蛋白质，为人肺腺癌发病机制及其早期诊断的研究提供理论依据。方法 采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离12例Ⅰ期肺腺癌及其相配的癌旁正常肺组织可溶性总蛋白，建立人Ⅰ期肺腺癌及相配癌旁正常肺组织蛋白质的双向电泳凝胶图谱；PDQuest凝胶图像分析软件比较分析，筛选出差异表达的蛋白质点；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得相应蛋白质点的肽质量指纹图谱；搜索蛋白质数据库鉴定差异表达的蛋白质。结果 建立了重复性较好的人Ⅰ期肺腺癌及相配癌旁正常肺组织蛋白质的双向电泳凝胶图谱；筛选出存在明显表达差异的蛋白质点26个，挖取其中的9个蛋白质点进行质谱分析，9个蛋白质点均得到了满意的肽质量指纹图谱；搜索蛋白质数据库鉴定出4种蛋白质，分别是：60S核糖体蛋白P2、组织蛋白酶B1、载脂蛋白AI前体和La 4.1蛋白。结论 成功建立了人Ⅰ期肺腺癌及相配癌旁正常肺组织蛋白质的双向电泳凝胶图谱，鉴定出4种在肺腺癌发生早期出现明显表达变化的蛋白质，为进一步探索人肺腺癌的发病机制及寻找特异性的早期分子标志物提供了理论依据。

    【关键词】  肺腺癌；蛋白质组学；双向凝胶电泳；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

    Differential Analysis of Twodimension Gel Electrophoresis Profiles of Human Earlystage Lung Adenocarcinoma and Tumoradjacent Tissue

    LIU Guizhi1, WU Yiming2

    1.Department of Physical Examination, First Teaching Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2.Department of Toxicology, College of Public Health, Zhengzhou University

    Corresponding  Author: WU Yiming,Email:wuym@zzu.edu.cnAbstract：Objective   To screen and identify differential expression proteins,and to obtain theoretical data for studying human stage Ⅰ lung adenocarcinoma molecular mechanism and finding early biomarker.Methods  The total proteins of 12 human stage Ⅰ lung adenocarcinoma tissue and normal tumoradjacent tissue were separated,using 170mm long immobilized pH gradient (IPG) gel strips,pH310,for the first dimension and homogeneous SDSpolyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE)（12%T） for the second dimension.The differential expression proteins were analyzed with PDQuest image analysis software,then identified using matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS) and database searching.Results  The wellreproducible 2DE gel patterns of human stage Ⅰ lung adenocarcinoma and normal tumoradjacent tissue were established and 26 differential proteins were screened.Nine of 26 differential protein spots were cut out from the preparation gels and were identified with MALDITOFMS.Comparing with the protein database,four candidate proteins were identified with MS. They were 60S acidic ribosomal protein P2,Cathepsin B precursor, Apolipoprotein AI precursor and La 4.1 protein.Conclusion  In this study,2DE gel images of human stage Ⅰ lung adenocarcinoma and paired normal tumoradjacent tissue were established successfully,and identified 4 differential proteins.These data will be helpful for studying human lung adenocarcinoma molecular mechanism and screening early biomarker.

    Key words：Lung adenocarcinoma; Proteomics; Twodimensional gel electrophoresis; Matrixassisted laser desorptionionization time of flight mass spectrometry

    肺癌是全世界公认的癌症中第一杀手。其发病隐匿，死亡率高。目前，早期诊断仍是提高肺癌患者生存率的关键措施。肺癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多因素调控异常的过程，若能直接从蛋白质整体水平入手，研究不同临床分期的肺癌，将能较全面、真实地揭示肺癌的癌变过程，为肺癌的早期诊断和预后评价提供特异的分子标志物。随着蛋白质组学的出现及其分析技术的不断发展和完善，为从整体水平展示和分析蛋白质提供了有力的技术支持。

    本研究拟采用蛋白质组学技术对人早期肺腺癌及相配的癌旁正常肺组织的蛋白质组进行研究，建立双向凝胶电泳图谱，并对差异表达的蛋白质点进行鉴定，以期为人肺腺癌发病机制及其早期诊断的研究提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  标本

    本组标本取自郑州大学第一临床医学院胸外科2005年3月～2006年5月间单一行外科手术治疗的12例Ⅰ期（T1N0M0，T2N0M0）肺腺癌患者。每例取材包括癌组织及相应的癌旁正常肺组织各一份，共24 份标本，癌组织和相配正常肺组织标本均经组织病理学检查证实。

    1.2  主要试剂

    固相pH 梯度(immobilized pH gradient，IPG)预制胶条(pH310，17cm)、3～10两性电解质biolyte、尿素、硫脲购自美国BioRad公司；CHAPS( 3[3胆酰胺丙基]二乙胺1丙磺酸 )，Aprotinin(抑肽酶)、PMSF(苯甲磺酰氟)、DTT(二硫苏糖醇)、碘乙酰铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS(十二烷基磺酸钠)、TEMED(N’N’N’N’四甲基乙二氨)购自Sigma公司。

    1.3  主要仪器

    双向凝胶电泳系统 PROTEIN IEF CELL 等电聚焦仪，PROTEAN xi cell电泳仪，GS800图像获取仪，PDQuest 7.1凝胶图像分析软件。为美国BioRad公司产品。

    1.4  组织总蛋白的制备

    80 ～ 100mg组织样品于液氮下充分研磨至粉末状,置于500μl裂解液(含7M尿素，2M硫脲，40mM Tris，4%CHAPS，1%TritonX100，100mM DTT，10.2%（w/v）BioLyte，0.5mM PMSF，0.5mM EDTA，1μg/ml Aprotinin)中，充分涡旋混匀，置37℃孵育1h，取出后再充分涡旋，15 000r/min、4℃离心30 min，吸取上清即为组织总蛋白质。采用BradFord法[1]测定样品的蛋白质浓度，置 80℃低温冰箱保存。

    1.5  固相pH梯度双向凝胶电泳

    主要按IPGphor等电聚焦系统指南的方法进行。一向等电聚焦电泳程序如下：50V主动水化，16h（17℃）；250 V除盐，30min；1 000V除盐1h；升压5h至10 000V，聚焦至80 000Vh。二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)条件如下：样品浓缩电流5mA/gel/17cm，样品分离电流30mA/gel/17cm。电泳所得的凝胶进行银染或考马斯亮蓝染色（考染）。

    1.6  双向电泳图谱分析

    染色后的SDS聚丙烯酰胺凝胶，用PDQuest 软件内部支持的图像扫描装置GS800扫描成像，数字化图像用PDQuest 7.1软件分析。图像分析过程包括蛋白质点的检测（detect spots on gels）、蛋白质点的编辑和匹配（edit spot和edit match）、蛋白质点的分子量（Mr）和等电点（pI）校正等[2]。

    1.7  胶内酶解及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDITOPMS）分析

    将扫描分析后的制备型考染凝胶置于明亮的灯光下,用硅烷化的枪头切取蛋白点，用2mg/L胰蛋白酶胶内酶解蛋白，得到的样品由上海基康生物技术有限公司协助完成MALDITOPMS鉴定，获得被检测样品的肽质量指纹图谱。

    1.8  数据库检索

    根据各肽段的m/z数据，用Mascot(http://www.matrixscience.com）和Profound(http://129.85.19.193/profoundbin/WebProFound.exe)软件，设置适当的搜索参数，在NCBInr、Swissprot蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白质，根据搜索结果，结合蛋白质在胶上的等电点和分子量最终确定目的蛋白质。

    2   结果

    2.1  人Ⅰ期肺腺癌组织及相配癌旁正常肺组织的双向凝胶电泳图谱

    对来自同一标本的总蛋白控制上样量为0.15mg，双向凝胶银染，进行3次重复性检测，结果显示3次双向电泳银染图谱非常相似。GS800获取图像，PDQuest 7.1软件点检测，获得Ⅰ期肺腺癌组织及相配癌旁正常肺组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1873±79和1715±63。通过背景消减，将其中的一块胶定为参考胶，进行3块胶间的蛋白质点匹配，Ⅰ期肺腺癌组织及相配癌旁正常肺组织平均匹配的点数分别为1576±62和1445±48，匹配率为87.1%和85.0%。获得了重复性较好的人Ⅰ期肺腺癌组织及相配癌旁正常肺组织的双向凝胶电泳银染图谱，见图1。

    2.2  人Ⅰ期肺腺癌组织及相配癌旁正常肺组织蛋白质表达图谱的分析及差异显示蛋白质的鉴定

    总蛋白控制上样量为0.15mg，对12例Ⅰ期肺腺癌组织及其相配的癌旁正常肺组织的蛋白质进行双向凝胶电泳，PDQuest 7.1软件分析，分别建立12块胶的平均凝胶银染图谱。在Ⅰ期肺腺癌组织蛋白质平均凝胶银染图谱上共检测到蛋白质点1977个，在正常肺组织蛋白质平均凝胶图上检测到蛋白质点1826个。将建立的平均凝胶进行匹配，经过反复比对，筛选出在Ⅰ期肺腺癌组织和正常肺组织中存在明显表达差异的蛋白质点26个（认为表达量相差5倍以上且至少在5对组织中均有相同变化的点为差异表达蛋白质点）。按上述方法，总蛋白控制上样量为3mg，制备双向电泳考染凝胶，从考染凝胶上找到与银染胶相对应的差异表达的蛋白质点，首批挖取实验分子量小于40kD的9个蛋白质点进行质谱鉴定。其中1、6、4、7号蛋白质点在相配正常肺组织中都有表达，而在Ⅰ期肺腺癌组织中表达明显减弱或消失，2、3和5号蛋白质点，仅在肺腺癌组织中表达，8和9号蛋白质点则在癌组织中表达明显增强，见图1。9个蛋白质点均获得了满意的酶解片断肽质量指纹图谱。搜索蛋白质数据库，结合候选蛋白的等电点、分子量与实验中测定的等电点、分子量是否一致等信息，最终鉴定出蛋白质4个，见表1。

    3  讨论

    利用蛋白质组学研究技术，国内外学者分别对肺癌细胞系，人体肺癌组织和相配癌旁正常肺组织进行了研究，建立了不同肺癌细胞系和正常支气管上皮细胞［35］、不同肺癌组织以及癌旁正常肺组织的双向电泳凝胶图谱［69］,并从中筛选出多种有意义的存在明显表达差异的蛋白质。目前，国内尚未见用蛋白质组学方法对肺腺癌做分期研究的文献。国外学者已经注意到不同分期的肺腺癌存在蛋白质 表1   4个差异表达蛋白质点肽质量指纹图谱搜索SWISSPROT数据库结果表达的差异，然而Ⅰ期肺腺癌与相配正常肺组织之间有哪些蛋白质表达的差异，Ⅰ期肺腺癌的双向电泳凝胶图谱如何，未见报道。

    本研究采用蛋白质组学技术，成功建立了人Ⅰ期肺腺癌和相配正常肺组织的蛋白质双向凝胶电泳图谱，并从中筛选出存在明显表达差异的蛋白质点26个，选取其中的9个蛋白质点进行质谱分析，搜索蛋白质数据库，最终只得到4种与实验分子量和等电点相一致的蛋白质。另外5种蛋白尽管得到了很好的肽质量纹图谱，但并没有在蛋白质数据库中找到与之分子量和等电点相匹配的蛋白质，可能的原因有：同一种蛋白可能存在多个剪切本、包含不同的亚基、经受不同的化学修饰如磷酸化、乙酰化等；同时也说明现阶段的蛋白质数据库并不完善，需要进一步的充实。这部分蛋白质尚待通过串联质谱或者氨基酸序列分析的方法再做进一步的鉴定。4种蛋白质分别是：60S核糖体蛋白P2，组织蛋白酶B1，载脂蛋白AI前体，La 4.1蛋白。

    在鉴定的4个蛋白质中，60S核糖体蛋白P2是一种酸性核糖体蛋白。酸性核糖体蛋白是一组多功能蛋白，由P0、P1和P2组成。一分子P0与两分子异二聚体P1/P2组成核糖体大亚基共有的柄，位于核糖体结构活性中心，在蛋白质合成中与mRNA、tRNA及转录因子相互作用，参与翻译过程中的调节机制。除此之外，酸性核糖体蛋白还有诸多核糖体外功能，如参与DNA修复，调节基因表达，参与物质代谢，且在肿瘤的发生、发展中起一定作用［10］。P0、P1、P2各成分的浓度对最终合成的蛋白质产物起关键作用，对某些代谢通路可产生非常重要的影响［11］。在本研究中，60S磷酸核糖体蛋白P2在Ⅰ期肺腺癌组织中表达量明显增高，这必将导致核糖体中P0、P1、P2各成分的浓度比例失调，而P0、P1、P2各成分浓度的相对稳定对最终合成的蛋白质产物起关键作用，这种改变势必影响某些蛋白质的合成，使正常组织功能失调，是否P2的高表达与肺腺癌发生有关，有待进一步研究。在本研究中，组织蛋白酶B1只在人Ⅰ期肺腺癌组织中表达，而正常肺组织中该蛋白点缺失。组织蛋白酶B1又称组织蛋白酶B前体或组织蛋白酶B原，该酶原在粗面内质网合成并被糖基化，糖基在高尔基体中进一步被磷酸化修饰，从而可被溶酶体上的6磷酸甘露糖受体识别，然后胞饮入溶酶体并被自身或其他蛋白酶激活。活化的组织蛋白酶B1称组织蛋白酶B，它能够促进肿瘤血管的增生，增强肿瘤细胞的运动能力，直接降解或激活纤溶酶原激活剂及基质金属蛋白酶等而间接降解许多细胞外基质成分，与肿瘤的生长和侵袭转移密切相关［1214］。有研究报道，在肺癌、乳腺癌等肿瘤中组织蛋白酶B表达量明显增高［15］，因此其前体蛋白含量很可能随之增高；另该酶的表达存在着转录水平和翻译后水平的调节，Gong等［16］研究发现，在肿瘤组织中，组织蛋白酶B基因的外显子2和3以及激活前体蛋白肽的7个氨基酸残基缺失，形成了特殊的mRNA产物，因其缺失信号肽，所以蛋白质合成后不能沿内质网途径进入溶酶体而弥散于胞浆中，组织蛋白酶B1激活障碍而含量增多。载脂蛋白AⅠ前体是本实验筛出的另一个差显蛋白，它在人Ⅰ期肺腺癌组织中表达沉默。载脂蛋白AⅠ是高密度脂蛋白中主要的蛋白成分。载脂蛋白AⅠ前体向成熟的载脂蛋白AⅠ的转化过程是在细胞外进行的，催化该反应的酶存在于血浆中。但有研究表明，体外培养的肝癌细胞系Hep G2，既能分泌载脂蛋白AⅠ前体，同时又能分泌把载脂蛋白AⅠ前体转化为载脂蛋白AⅠ的转化酶，直接把该前体转化为成熟的载脂蛋白AⅠ［17］。是否在人Ⅰ期肺腺癌组织中也存在相似的转化过程使载脂蛋白AⅠ前体全部转化成了成熟的载脂蛋白AⅠ，确切机制尚待进一步研究证实。La4.1蛋白是La蛋白的一种，La蛋白是一种核蛋白，同时也是早期干燥综合征病人血清中自身抗体的主要靶抗原，该蛋白与肿瘤的关系尚不清楚。

    本研究应用蛋白质组学方法，初步建立了人Ⅰ期肺腺癌的双向电泳凝胶图谱，并鉴定出4种在肺腺癌发生早期表达明显异常的蛋白质，对这些蛋白质的进一步研究，将为肺腺癌的早期诊断提供可能的分子标志物。

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