癌热宁栓剂直肠给药对家兔非感染性发热体温、血清TNFα、IL1β及下丘脑PKA含量的影响

    作者：贾英杰,李小江,孙一予,张莹,陈军,张蕴超    作者单位：天津中医药大学第一附属医院肿瘤科     【摘要】  目的 观察癌热宁栓剂的解热机制。方法 采用2,4二硝基酚致家兔发热模型，测定给药后不同时间的体温变化，并采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清TNFα、IL1β含量的变化，使用免疫组织化学方法分析下丘脑蛋白激酶A（PKA）与体温变化关系。结果 癌热宁栓剂高、中、低剂量组对家兔非感染性发热有明显的解热作用（P<0.05），其中高、中剂量组与模型组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。能够明显降低血清TNFα、IL1β含量。相关分析显示，5组家兔的体温变化分别与下丘脑PKA含量变化呈正相关。结论 癌热宁栓剂对由2,4二硝基酚引起的非感染性发热动物模型具有解热作用。能够抑制血清中TNFα、IL1β含量的增多，同时，降低下丘脑cAMPPKA的水平，可能是癌热宁栓剂的重要解热机制之一。

    【关键词】  癌热宁栓剂;非感染性发热;肿瘤坏死因子α;白介素1 β;蛋白激酶A

   Effects of Cancer Rening Suppository on Temperature，Levels of TNFα,IL1β in Serum and Hypothalamus PKA Content of Feverish Rabbits Induced by Noninfection

    JIA Yingjie,LI Xiaojiang,SUN Yiyu,ZHANG Ying,CHEN Jun,ZHANG Yunchao

    Department of Oncology,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China Abstract：Objective   To adverse reaction of Cancer Rening suppository in the treatment of fever cancer.Methods  The models of noninfected fever induced by 2,4binitrophenol was used to observe the changes of temperature in different time,TNFα and IL1β in the serum of rabbit were determined by double antibodies sandwich Enzymelinked Immurosorbent Assay.Immunohistochemical assay was used to detect the expression between PKA activities of hypothalamus and the changes of temperature.Results  Different doses of Cancer Rening suppository (13.5g/kg,4.5g/kg,1.5g/kg) reduced the febrile responses of rabbit induced by noninfected fever.In the febrifuge experiment of rabbit,both the high and middle group have the febrifuge effect obviously.Changes of TNFα、IL1β in serum and PKA in hypothalamus during noninfected fever induced by 2,4binitrophenol in rabbits are significantly increased.Cancer Rening suppository has a protective effect on noninfected fever induced by 2,4binitrophenol in rabbits,decreasing the expression of TNFα、IL1β in serum and PKA in hypothalamus obviously.Correlation analysis indicated that the changes of the rabbit body temperature were positively correlated with the contents change of PKA in the hypothalamus of the five rabbit groups.Conclusion  The antipyretic mechanisms of Cancer Rening suppository may be related to its decreasing the contents of TNFα、IL1β in serum and PKA in hypothalamus.It may be an important antipyretic mechanism of Cancer Rening suppository.

    Key words：Cancer Rening suppository;Noninfectious fever;TNFα ;IL1β;PKA

癌热宁栓剂是根据中医理论，经科学研制而成的中药复方制剂。具有清热解毒、祛瘀凉血的功效。临床主要用于癌性发热或非感染性发热。前期毒理实验结果表明本品临床使用安全。而有关其解热机制尚未报道。为研究本品的解热作用及机制，我们利用2,4二硝基酚制备家兔非感染性发热动物模型，通过了以下动物学试验，从而为临床用药提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  长耳大白兔30只，雌雄各半，体重2.5±0.5kg，由天津中医药大学实验动物中心提供，许可证编号：津动许字（1996）第001号。

    1.1.2  药物  癌热宁栓剂，由银柴胡、地骨皮、白花蛇舌草、虎杖等药物经临床试验确定组方，栓剂由本院药厂制备6g/粒。中药浸膏，水煮醇沉法，动物直肠给药，每毫升含生药3g。

    1.1.3  试剂  2,4二硝基酚，规格：25g，批号CNAB035Q（天津市永记商贸有限公司）。无水乙醇（分析醇）500ml，批号9610355（天津王兰庄化学试剂厂）。甲醛（分析醇）500ml，批号20040803（天津登峰化学试剂厂）。PKAγ cat (C20)一抗，sc905（Santa Cruz生物公司）。

    1.1.4  仪器  MGAⅢ219型电子测温仪；IL1β ELISA酶联免疫分析试剂盒，由北京尚柏生物医学技术有限公司提供；TNFα ELISA酶联免疫分析试剂盒，由北京尚柏生物医学技术有限公司提供；酶联免疫检测仪，3550型，美国BIORAD产品；SG800型低速台式离心机。

    1.2  方法

    1.2.1  家兔的选择  实验前以MGAⅢ219型电子测温仪，每日测家兔肛温1次，连续3日，取其平均值作为基础温度。选择体温范围在38℃～39.5℃，且体温波动在0.5℃以内者，用于实验[1]。

    1.2.2  2,4二硝基酚致热量的确定  根据以往报道[2]，本实验经预试验后将2,4二硝基酚致热量确定为30mg/kg，试验前用无水乙醇配置，2℃～5℃保存。

    1.2.3  造模与分组  利用2,4二硝基酚刺激家兔出现无菌性炎症，模拟临床非感染性发热模型[3]。实验日，取上述合格家兔，测定基础体温后，根据体温随机分为5组，除其中一组不做处理为空白对照组外，其余4组分别于背部皮下注射2,4二硝基酚乙醇溶液，剂量为1.5ｍl/kg，2h内诱导体温升高超过1℃为发热模型，将发热动物随机分为模型对照组、癌热宁栓剂高、中、低剂量组。

    1.2.4  给药  癌热宁栓剂高、中、低剂量组分别通过直肠予9粒/只，3粒/只，1粒/只不同剂量的药物，即含生药量为13.5g/kg，4.5g/kg，1.5g/kg，各给药组分别于造模后3h予直肠粘膜1次接触性给药。

    1.2.5  观察指标

    （1）对体温的影响  观察造模后0.5、1、2、3、4、5、6h时各组动物直肠温度变化，描记平均体温反应曲线（MTRC）[4]，统计平均最大体温反应高度（ΔT）及平均3h体温反应指数（TRI3），TRI计算参照Milton法[5]，以发热曲线与体温基线之间的面积表示，并按下列方法计算TRI。

    体温反应指数（TRI）的计算方法以体温值为纵坐标，5cm=1.0℃；以时间值为横坐标，1cm=10min。以注射前三次体温的平均值（取0.1℃之整数）作为两坐标的交点，横坐标即为体温基线，上升值为正，下降值为负。将各时间点体温变化数值在坐标纸上描绘成体温变化曲线（发热时为发热曲线）。体温变化曲线与体温基线之间的面积即为体温反应指数。发热时，即称为发热指数，是反映发热效应强度的较好指标。

    （2）对血清IL1β、TNFα含量的影响  各组家兔于造模前、造模后3h（此时发热达高峰）以及造模后6h从耳缘静脉采血2ml静置离心后分离血清，-70℃保存待测，按试剂盒说明书操作。

    （3）对下丘脑PKA含量的影响  实验结束后，立即断头处死动物，迅速取出全脑，于视交叉与灰结节之间取下丘脑组织，经过处理，综合分析整张切片的阳性细胞数及染色强度。

    1.2.6  统计学方法  使用SPSS 11.5统计软件数据包处理。

    2  结果

    2.1  家兔体征

    注射2,4二硝基酚后30min家兔体温开始上升，并出现耸毛、发抖、蜷缩；至2h，随着体温明显升高，家兔耸毛、发抖、蜷缩逐渐消失，但呼吸明显急促及心跳加快。由于全身灼热，家兔耳廓发红发热，眼结膜充血，但神志清醒。用癌热宁栓剂治疗其体征则明显减轻。

    2.2  对模型动物体温的影响

    造模0.5h后开始发热，约3h逐渐达发热高峰，模型组体温明显高于空白组。癌热宁栓剂高、中、低剂量组体温变化比模型组降低（P<0.05），其中癌热宁栓剂高、中剂量组较模型对照组差异具有统计学意义（P<0.01），与空白组相比差异无统计学意义（P>0.05）。癌热宁栓剂3组ΔT、TRI3均比模型组明显降低（P<0.05）。说明癌热宁栓剂对模型动物有抑制发热及解热作用，能完全对抗2,4二硝基酚引起的发热效应，见表1、2。

    2.3  对模型动物血清IL1β、TNFα水平的影响

    造模后2h，造模动物血清IL1β、TNFα含量明显升高，而给药后，癌热宁栓剂各组则比造模组明显下降（P<0.05），提示癌热宁栓剂对模型动物血清IL1β、TNFα升高效应有抑制作用，见表3、4。表1  造模前后动物体温的变化与本组造模前体温比较，*:P<0.05，**:P<0.01；与模型对照组比较，:P<0.05，:P<0.01表2  癌热宁栓剂对模型动物ΔT和TRI3的影响组别剂量例数（只）ΔT（℃）TRI3（cm2）正常对照组－60.05±0.081.17±8.67模型对照组－62.12±0.88*119.5±36.5*癌热宁低剂量组1.5g/kg60.75±0.15*74.3±14.7*癌热宁中剂量组4.5g/kg60.47±0.1489.1±14.3*癌热宁高剂量组13.5g/kg60.08±0.2090.6±15.7*

    与正常对照组比较，*:P<0.05；与模型对照组比较，:P<0.05表3  癌热宁对家兔发热高峰血清与本组造模前比较，*:P<0.05；与本组造模时比较，:P<0.05；与模型对照组比较，★:P<0.052.4  对模型动物下丘脑PKA含量的影响

    空白组及高剂量组PKA表达微弱，见图1、5；模型组PKA表达呈弥漫性，主要表达于神经元细胞的胞浆及血管内皮细胞内，见图2、3；癌热宁栓剂中、高剂量组则明显低于模型对照组，见图4、5、2。提示癌热宁栓剂对2,4二硝基酚引起的家兔下丘脑PKA含量升高有明显抑制作用。表4  癌热宁对家兔发热高峰血清与本组造模前比较，*:P<0.05；与本组造模时比较，:P<0.05；与模型对照组比较，★:P<0.05

    3  讨论

    发热主要是外源性致热原作用于体内单核巨噬细胞产生并释放内生致热原（endogenous pyrogen，EP）而致。近年来的研究发现EP不止一种，包括白介素（IL1）、肿瘤坏死因子（TNFα）、干扰素（IFN）、巨噬细胞炎症蛋白1（MIP1）等。其作为发热信息可直接或间接作用于体温调节中枢，导致下丘脑某些发热介质[6]如cAMP、促皮质激素释放激素（CRH）等的释放，使调定点上移，产热增加，散热减少而发挥致热作用。近来，随着分子生物学技术的迅速发展以及发热发病学的深入研究，已有实验证实[7]，cAMP/PKA通路参与了机体体温的调节，cAMPPKA信号转导途径在细胞内机制中占有非常重要的地位[8]。当前，PKA与体温调节的相关研究已普遍受到关注。

    TNFα是一种由单核巨噬细胞产生的多功能单核细胞因子，TNFα的释放在发病过程中可以直接引起细胞损伤，也能通过刺激其他促炎症介质如 IL 1、IL 6 的释放扩大炎症级联反应[9]。

    IL1是重要的致热性细胞因子，因基因编码不同分为IL1α和IL1β两型，IL1β具有明显的致热性。目前证实[10]参与IL1β信号转导的磷脂酶类主要包括磷脂酶A2（PLA2）。其活化可使花生四烯酸（AA）从磷脂酶的SN2位释放，因此成为磷脂类炎症介质产生的限速酶。许多研究表明，IL1可刺激不同细胞的PLA2基因表达以及蛋白合成，并使其活性增加，进而分解膜磷脂类产生AA，并通过诱导COXⅡ活化导致PGE2的生成与释放[11,12]。后者除作为生物活性物质直接影响细胞功能外还可激活腺苷酸环化酶（AC）使细胞内cAMP增多，cAMP是细胞内重要的第二信使，起着将细胞外刺激信号转化为细胞内各种生理活动的媒介作用，它可与cAMP依赖性的蛋白激酶A(PKA)的结合亚基结合，使其激活。激活后的PKA既可以使细胞内多种蛋白质磷酸化而发挥生物学作用，还可以作用于cAMP反应元件结合蛋白，调节基因表达以发挥生物学作用。其主要过程为PLA2→AA→PGE2→cAMP→PKA→引起发热生物学效应。

    本文研究结果显示，癌热宁栓剂能显著降低血清TNFα、IL1β活性；通过阻断cAMP与细胞内PKA的结合，不同程度地抑制家兔下丘脑神经细胞因2,4二硝基酚刺激而导致的cAMP/PKA水平升高。因此表明癌热宁栓剂解热作用可能与调节cAMP/PKA信号通路有一定的关系。

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