小鼠编码锌指蛋白基因zfp637的初步研究

    作者：任婧婧，张 洁，刘 凯，王修杰，杨洪亮，王 琪，熊竹娟，吴亚英，高艳萍，林苹    作者单位：成都，四川大学华西医院肿瘤生物治疗国家重点实验室实验肿瘤研究室     【摘要】  目的 观察zfp637基因对肿瘤细胞生长增殖的影响。方法 半定量RTPCR检测 zfp637基因在小鼠正常组织与肿瘤细胞株中的表达。设计并合成4对小分子双链RNA,半定量RTPCR筛选最佳干扰效应位点。将siRNA 转染 EMT6细胞，转染后1～4d进行细胞增殖实验。结果 zfp637在多数正常组织呈低到中度表达，外周血单个核细胞未见表达。在小鼠肝癌H22，小鼠肝癌细胞Hepal6，Lewis肺癌LL/2，黑色素瘤细胞 B16，淋巴瘤细胞Yac1和乳腺癌细胞EMT6中均呈现高表达。筛选后表明siRNA881为最佳干扰效应位点。 细胞增殖实验（MTT）显示：转染siRNA后第4d，实验组EMT6细胞增殖明显低于阴性对照组，1～3d实验组细胞增殖与阴性组相差不明显。结论 zfp637基因在不同正常组织和肿瘤细胞株中表达水平不同。 zfp637很可能是促进细胞增殖的正调控因素。下调该基因表达能抑制EMT6肿瘤细胞增殖。

    【关键词】  锌指蛋白637；肿瘤细胞；化学合成小分子干扰；细胞增殖

     Primary Study of Mouse Zinc Finger Gene zfp637

    REN Jingjing,  ZHANG Jie,  LIU Kai, WANG Xiujie, YANG Hongliang, WANG Qi, XIONG Zhujuan, WU Yaying, GAO Yanping, LIN Ping

    Division of Experimental Oncology,  National Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

    Corresponding  Author: LIN Ping，Email:linping9@yahoo.com.cnAbstract：Objective   To investigate the impact of zfp637 on proliferation of cancer cells.Methods  The expression of zfp637 in normal tissues and cancer cell lines was examined by semiquantity RTPCR analysis. Small double strands interfering RNA (siRNA) was    synthesized, and then screen the best interfering site. After that, proliferation of RNAi treated EMT6 cells was analyzed via 96well plate approach. The assay was performed on day 1～4.Results  zfp637 was expressed moderately in most normal tissues, highly expressed in Yac1,EMT6,B16, H22, LL/2 and Hepal6, but not expressed in peripheral blood leukocyte. The zfp637specific siRNAs substantially reduced the proliferation of EMT6 cells on the 4th day.Conclusion  zfp637 was expressed at different levels in multiple tissues and various cancer cell lines. It probably functions as a positive regulator of cellular proliferation. Down regulation of its expression  in EMT6 cancer cells by RNAi led to a remarkable reduction of proliferation.

    Key words：Zinc finger protein 637; Cancer cell; Chemosynthesized small interfering RNA; Cell proliferation

锌指蛋白家族是一个超大的基因家族，据估计，在人类基因组中约1%的基因编码锌指蛋白，其中最大的亚家族为Cys2/His2型的锌指蛋白，基因总数超过700个[1] 。研究证实，具备经典C2H2模序结构的锌指蛋白主要通过与 DNA相互作用而起转录因子的作用。它们通过调控基因表达决定细胞的显性特征。在高等生物体的细胞增殖、组织分化、发育中起关键作用 [24] 。

    小鼠zfp637基因，目前仅有其染色体定位及结构预测，尚无针对其功能的研究报道。本研究对该基因在正常组织和肿瘤细胞株中的表达及其对肿瘤细胞增殖生长的影响进行了初步探讨。

    1  材料和方法

    1.1  材料和试剂

    提取组织来源为C57BL/6J雌性小鼠 ，购自四川大学华西医学实验动物中心 。小鼠腹水性肝癌细胞株H22，小鼠Lewis肺癌细胞株LL/2，小鼠肝癌细胞株Hepal6, 小鼠黑色素瘤细胞株B16，小鼠淋巴瘤细胞Yac1和小鼠乳腺癌细胞株EMT6均由本室保存。

    RNA提取试剂盒（上海华舜生物公司）。RTPCR两步法试剂盒（成都博瑞克公司）。Lipofectamine2000 转染试剂 (Invitrogen)；小牛血清、胎牛血清（武汉三利公司）；RPMI1640（Gibco）；胰蛋白酶，DMSO和四甲基偶氮唑盐[3（4，dimetnylthiazole2y,2,5diphenyl tetrazolium bromide）,MTT]（北京华美生物公司）。

    1.2  细胞及培养

    EMT6,Yac1用含10%小牛血清、100u/ml 青霉素、100u /ml 链霉素的RPMI1640完全培养基。Hepal6、LL/2、B16用含10%胎牛血清、100u/ml 青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM(high glucose)完全培养基，以上均在 37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。复苏H22细胞并接种C57BL/6J小鼠，以获得腹水型肝癌细胞H22。

    1.3  RNA提取

    按照上海华舜生物公司组织RNA提取说明书进行组织和细胞的RNA提取。用凝胶成像仪分析RNA电泳结果判断完整性，紫外分光光度计测定RNA纯度，同时进行RNA定量。

    1.4  半定量RTPCR检测zfp637在正常组织与肿瘤细胞mRNA水平表达

    引物设计: （1）扩增zfp637基因片断引物  S 5′CTG CGG TTC TCC AGA C 3′， A 5′CTC TTG ATT ACT GAG GGC TTT 3′,目的基因产物955bp。（2）以β肌动蛋白作为内参照, S: 5′CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C 3′，A: 5′GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T 3′，扩增产物659bp。反应条件为94℃预变性3min,94℃30s,60℃45s，72℃1min,30个循环，72℃5min。反应产物于1.2%琼脂糖电泳65V,40min。凝胶成像系统（BioRad）采图，用Quality One4.4.0软件进行图像分析。计算zfp637/βactin密度比值（％），以30％，60％作为低，中，高标准的分界点。

    1.5  最佳干扰效应位点的筛选

    针对靶基因设计4个不同位点的siRNA（上海吉玛生物公司设计合成）如下：

    取对数生长期的EMT6，计数并以每孔1.5×105接种于6孔板。1d后转染，每孔250μl无血清无抗生素1640培养基稀释4μgsiRNA， 250μl无血清无抗生素 1640培养基稀释8μl lipofectamine 2000,具体操作按照Lipofectamine2000（Invitrogen）说明书进行。转染48h后提取RNA，按两步法RTPCR试剂说明进行基因扩增，检测zfp637mRNA水平表达情况。PCR反应条件：94℃预变性3min,94℃30s,60℃45s，72℃1min，25个循环，72℃5min。扩增产物于1%琼脂糖电泳，并用凝胶成像仪进行灰度扫描和密度分析，计算干扰效率。干扰效率(%)=〔阴性组zfp637/βactin密度比值-处理组zfp637/βactin密度比值〕/（阴性组zfp637/βactin密度比值),筛选出干扰效应最强的siRNA。

    1.6  细胞增殖实验（MTT）

    转染前1d，用无抗生素的1640培养基调整EMT6细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔板，每孔200μl，培养过夜。次日按照每孔siRNA：脂质体（lipofectamine2000）=100ng∶0.3μl,设立空白对照组，阴性对照组和实验组，每组5个副孔。转染参照试剂说明书进行。转染后1～4d每天进行MTT测定：每孔加入MTT10μl(5mg/ml),继续培养4h后弃去上清液，加入150μlDMSO,震荡5～10min，于酶标仪上用570nm波长测定各孔吸光值（A值）。按以下公式计算：细胞增殖抑制率（%）=（未处理组A值处理组A值）/未处理组A值×100%，实验重复3次。

    2  结果

    2.1  zfp637基因mRNA水平表达谱

    该基因在正常组织中呈低到中度表达，其中脑、肺、肾、肝和脾脏为中度表达，心脏、胸腺、胰腺和骨髓为低度表达，外周血单个核细胞未见表达，见图1。在肿瘤细胞株H22、Hepal6、LL/2、B16、Yac1、EMT6中均呈现高表达，见图2。表1  4个不同位点的siRNA序列

    2.2  特异性siRNA对EMT6细胞中zfp637 mRNA水平的影响

    通过RTPCR电泳及凝胶成像仪密度测定，结果显示zfp637 siRNA881干扰效率为67.14%，干扰效果最强，见图3。

    2.3  zfp637 siRNA881转染EMT6细胞

    细胞增殖实验所测A值用SPSS13.0软件进行多样本均数的方差分析，结果显示：第1天和第2天， 实验组与阴性组比较（P均为0.040）,P接近0.05，由于样本例数少，不能肯定两者之间差别有意义。第3天， 实验组与阴性组比较（P=0.039），亦不能得出肯定结论。第4天，实验组与阴性组比较（P=0.001），认为两者差异有统计学意义。对第4天细胞增殖抑制率单独进行t检验发现，实验组明显高于阴性对照组（P＜0.01），见图4。

    3  讨论

    锌指转录因子基因是脊椎动物基因组中重要的一部分[5]。C2H2锌指通常串联排列，绝大多数转录因子有3个或3个以上锌指结构，共同特异性的识别   DNA或RNA[6]。锌指蛋白N末端通常有不同的结构域，以调节转录因子的功能，这些结构域包括BTB、KRAB、FAX、POZ、SCAN 以及LeR等[7]。

    研究表明，某些C2H2锌指蛋白不仅可以调控正常器官发育，而且在肿瘤发展中有着潜在的分子机制[8]。PLAG1通过上调IGFⅡ生长因子的表达，刺激细胞增殖而产生致瘤效应[9]。  ZNF268在胚胎及白血病的血细胞发育中起作用[10]。Bsg6与脑器官形成以及肿瘤形成有关[11]。Nolz与纹状体神经元发育有关[12]。Hzf1在红白血病诱导分化中起一定作用[13]。ZT2与鼠骨骼组织发生和分化有关[14]。Znf217在上皮性肿瘤出现扩增，减弱细胞凋亡信号，导致端粒异常，促进致瘤性转化[15]。在细胞中表达ZZaPK则可通过增加E2F的表达和cyclin E的活性而启动细胞的生长[16]，而Lotl则能逆转细胞凋亡和细胞周期阻滞过程[17]。

    生物信息学分析zfp637定位于6号染色体,其cDNA共1114bp,开放读码框编码272个氨基酸(GeneID: 232337)。结构预测SMART (http://smart. emblheidelberg.de)具备C2H2经典锌指模序结构。通过综合多个蛋白质结构功能预测软件NPS@PROSCAN, EXPASY, EMBLEBI以及Interproscan的分析结果，发现zfp637具有典型的7个C2H2结构域，可能具备蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N末端豆蔻酰化位点以及EGFlike结构域等。还可能是Krueppeltype C2H2锌指蛋白（EMBLEBI），G2/M过渡的下调因子（NCBI Conserved domain）。 但是目前均无相关实验证实。

    本实验中研究了zfp637基因表达分布情况，正常组织中呈现低至中度表达，甚至不表达，而在肿瘤细胞株中均呈现高表达，提示zfp637基因可能与肿瘤形成有一定关系。

    RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)所引起的mRNA水平的序列特异性基因沉默,是一种了解基因功能的强大工具。mRNA的降解是基因表达调控的一个关键环节[1820]。由于其操作的简便性和下调靶基因表达的高效性，近年来成为基因功能研究和抗肿瘤研究的热点。本实验通过干扰下调zfp637基因的表达，发现在转染后第4天肿瘤细胞的增殖明显受抑制，由此推论zfp637基因可能有促进细胞增殖的作用。基于小干扰 RNA作用的短暂性，转染细胞4天后效应会减弱以至消失，尚未能进行长期的细胞生物学行为研究。但通过筛选有效的干扰小片段，为今后将其构建至载体，并且筛选稳定干扰细胞株进行深入研究奠定了实验基础。

【参考文献】[1] Collins T, Stone JR, Williams AJ. All in the family:the BTB/POZ,KRAB,and SCAN domains[J].Mol Cell Biol, 2001,21(11) :36093615.

[2] Perry C,Soreq H.Transcriptional regulation of erythropoiesis.Fine tuning of combinatorial multidomain elements[J].Eur J Biochem,2002,269(15):36073618.

[3] Ganss B,Jheon A.Zinc finger transcription factors in skeletal development[J].Crit Rev Oral Biol Med,2004,15(5):282297.

[4] Aruga J.The role of Zic genes in neural development[J].Mol Cell Neurosci,2004,26（2）:205221.

[5]Xing G,Mei Z,Xiangwei F,et al.ZNF435,a Novel Human SCANcontaining Zinc Finger Protein,Inhibits AP1mediated Transcriptional Activation[J].Mol Cells,2007,23(3):316322.

[6] Duo Lu,Alexandra SM,Aaron K.Crystal structure of a zincfinger–RNA complex reveals two modes of molecular recognition[J].Nature,2003,426(6962):96100.

[7] Williams AJ,Khachigian L,Mand CT.Isolation and characterization of a novel zincfinger protein with transcriptional repressor activity[J].J Biol Chem,1995,270(38):2214322152.

[8] Gebelein B,Fernandez Zapico M,Imoto M,et al.KRABindependent Suppression of Neoplastic Cell Growth by the Novel Zinc Finger Transcription Factor KS1[J].J Clin Invest,1998,102(11):19111919.

[9]Voz ML,Agten NS,Van de Ven,et al.PLAG1,the Main Translocation Target in Pleomorphic Adenoma of the Salivary Glands,Is a Positive Regulator of IGFII[J].Cancer Research,2000,60(1):106113.

[10]MingXiong G,Di W,HuanJie S,et al.Transcription of Human Zinc Finger ZNF268 Gene Requires an Intragenic Promoter Element[J].J Biol Chem,2006,281(34):2462324636.

[11]慈宏亮,李昱华,陈微,等.小鼠BTB/锌指结构新基因Bsg6的克隆及表达谱分析 [J].中国生物化学与分子生物学报,2006,22(2):117123.

[12]Chiung Wen C,Chi Wei T,Hsiao Fang W,et al.Identification of a developmentally regulated striatumenriched zincfinger gene,Nolz1,in the mammalian brain[J].PNAS,2004,101(8):26132618.

[13]Peng H,ZW Du,JW Zhang.Identification and characterization of a novel zinc finger protein (HZF1) gene and its function in erythroid and megakaryocytic differentiation of K562 cells[J].Leukemia,2006,20(6):11091116.

[14]Giorgi S,Polimeni M,Senni MI,et al.Isolation and characterization of the murine zinc finger coding gene,ZT2:expression in normal and transformed myogeniccells[J].Gene,1999,230(1):8190.

[15]Huang G,Krig S,Kowbel D,et al.ZNF217 suppresses cell death associated with chemotherapy and telomere dysfunction[J].Hum Mol Genet,2005,14(21):32193225.

[16]Yemg J J.A novel zinc finger protein,ZzaPK,intemcts with ZAK and stimulates the ZAKexpressing cells reentering the cell cycle[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,301(1):7177.

[17]Ciani E,Frenquelli M,Contestabile A.Developmental expression of the cell cycle and apoptosis controling gene,Lotl,in the rat cerebellum and in cultures of cerebellar granule cells[J].Brain Res Dev Brain Res,2003,142(2):193202.

[18]Bevilacqua A,Ceriani MC,Capaccioli S,et al.Posttranscriptional regulation of gene expression by degradation of messenger RNAs[J].J Cell Physiol,2003,195(3):356372.

[19]Khodursky AB, Bernstein JA.Life after transcriptionrevisiting the fate of messenger RNA[J].Trends Genet,2003,19(3):113115.

[20]Vasudevan S,Peltz SW.Nuclear mRNA surveillance[J].Curr Opin Cell Biol,2003,15(3):332337.