生存素siRNA表达质粒对结肠癌细胞侵袭和增殖能力的抑制作用

    作者：尤振兵，何敬东，喻晓娟    作者单位：南京医科大学附属淮安第一医院     【摘要】  目的 构建针对生存素的小分子RNA干扰表达质粒，研究siRNA表达质粒沉默生存素基因后对大肠癌细胞株SW480侵袭性和增殖性的影响。方法 用pRNAT U6.1/Neo载体构建生存素 siRNA表达质粒（pRNAT/sursiRNA），该质粒转染SW480细胞株48小时后，用Westeron blot和半定量 RTPCR分析生存素蛋白和mRNA表达的变化。G418 400μg/L筛选阳性克隆细胞株（sursiRNA/SW480），MTT法检测SW480细胞体外增殖的变化；细胞侵袭性实验研究SW480细胞的侵袭性变化。结果 成功地构建了pRNAT/sursiRNA表达质粒，并且该质粒明显下调SW480细胞生存素蛋白和mRNA的表达水平，分别下调85%，80%。G418 400μg/L筛选出转染pRNAT/sursiRNA的SW480细胞株（sursiRNA/SW480）；sursiRNA/SW480细胞增殖受到显著抑制，抑制率为37.4% (P<0.01)；细胞侵袭实验示sursiRNA/SW480细胞的穿透数为(153±66)个，而对照组pRNAT/SW480、SW480细胞的穿透数为(505±65)，(578±98)个细胞，sursiRNA/SW480细胞的穿透数与对照组相比显著减少(P<0.01)。结论 针对生存素siRNA可以显著降低生存素的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，该生存素siRNA序列可能成为治疗结肠癌的一种有效手段。

    【关键词】  生存素；RNA干扰；细胞侵袭；结肠癌

    siRNA Aiming at survivin Inhibit Invasive Ability and Proliferation of Colorectal Cancer Cell Line

    YOU Zhenbing，HE Jingdong，Yu Xiaojuan

    Department of Oncology，Huaian First Hospital Affiliated of Nanjing Medical University, Huaian 223300,China

    Corresponding Author:HE Jingdong,Emial:hjddoctor@yahoo.com.cnAbstract：Objective   To construct expression vectors of small RNA interference aimed at survivin gene and to explore effect of survivin siRNA gene on proliferation and invasive ability of SW480 cell line.Methods  A survivin siRNA plasmid （pRNAT/sursiRNA）was constructed using pRNAT U6.1/Neo vector. After pRNAT/sursiRNA vectors were transduced into SW480 cell line 48 hours, the expression level of survivin mRNA and protein were measured by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and Western blot analysis, the effect of pRNAT/sursiRNA vectors on SW480 cell line proliferation and invasive ability were evaluated by MTT assay and cell invasion experiment, respectively.Results  survivin siRNA expression plasmid （pRNAT/sursiRNA）was constructed successfully and pRNAT/sursiRNA downregulated expression level of survivin gene protein and mRNA dramatically in SW480 cell,85%,80% respectively. SW480 cell containing pRNAT/sursiRNA vectors (sursiRNA/SW480) was selected by G418 400μg/L. MTT assay showed proliferation of sursiRNA/SW480 cell was inhibited obviously (inhibition ratio was 37.4%), lower than proliferation of control group cell (P<0.01). Cell invasion experiment showed that cell numbers of sursiRNA/SW480, pRNAT/SW480 and SW480 cell, that penetrated membrance, were 153±66, 505±65 and 578±98, penetration numbers of sursiRNA/SW480 cell was reduced obviously, compare to control groups cell (P<0.01). Conclusion  The siRNA aimed at survivin gene could reduce the expression level of survivin gene protein and mRNA, and inhibit proliferation and invasive ability of SW480 cell line. The sequence of RNA interference against survivin may be a validity method to treat colorectal cancer.

    Key words：survivin; RNAi; Invasive ability; Colorectal cancer; Gene therapy

     0  引言

    survivin选择性地在肿瘤组织中表达而在正常成熟组织中不表达，在结直肠癌高表达且与肿瘤发生、发展有关［1］。其与细胞凋亡密切相关，但是有关它对结直肠癌增殖及侵袭能力的影响研究报道较少［2,3］。本研究构建survivin siRNA表达质粒并转染SW480细胞，分析survivin siRNA表达质粒对survivin基因沉默的效率及其对结肠癌细胞株SW480细胞增殖及细胞侵袭能力的影响。为RNA干扰survivin基因治疗结直肠肿瘤提供新的、有效的RNA干扰序列。

    1  材料和方法

    1.1  主要材料与试剂

    pRNAT U6.1/Neo载体（Gene script 公司），限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ（Promega，美国），含survivin shRNA序列的核苷酸由上海博亚生物有限公司合成，survivin单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology. Inc.），细胞转染试剂lipfection 2000 (Invitrogen life公司 )，总RNA提取试剂Trizol LS Reagent（Gibco BRL公司），细胞蛋白提取试剂盒（碧云天生物公司）。PVDF膜购自Pall公司。MTT 购自上海生物工程技术公司；RPMI1640培养基购自Sigma公司；结肠癌细胞株SW480由本实验室保种，SW480 细胞培养液含100ml/L 灭活的小牛血清、100 KU/L青霉素和链霉素的RPMI1640培养液。Matrigel（BD PharMingen公司），transwell（Millipore公司）。其他为国产生化试剂。

    1.2  pRNAT/sursiRNA表达质粒的构建

    shRNA序列由GeneScript提供软件GeneScript′s siRNA Target Finder and siRNA Congstruct Builder并根据Survivin基因（NM_001168）在线设计。shRNA序列为CCGCATCTCTACATTCAAGAA起始位置为100。siRNA 插入片段为76bp，序列见图1：

    两条核苷酸链稀释为40ng/μl、按照20μl反应体系：1μl 5′3′ 核苷酸、1μl 3′5′ 核苷酸、1μl  20×SSC、17μl H2O；按照下列反应体系退火，95℃×10min，25℃×1h，产物。

    siRNA插入片段插入经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切的pRNAT U6.1/Neo载体，抗生素筛选阳性克隆，测序验证构建的pRNAT/sursiRNA表达质粒。

    1.3  细胞转染  按照Lipofectamine2000 试剂说明书进行。用无血清培养基分别溶解pRNAT/sursiRNA表达质粒和pRNAT空质粒，将Lipofectamine2000与核苷酸混合于聚苯乙烯试管中，室温下静置30min 后，转染SW480细胞株。G418 400g/L筛选阳性克隆细胞株（含pRNAT/sursiRNA表达质粒的SW480细胞）。

    1.4  RTPCR 检测survivin mRNA的表达  用TRIzol提取细胞总RNA，分光光度计检测各组细胞总RNA的A260/A280为1.90～1.96；细胞总RNA 经电泳分离后，可见清晰的28s及18s RNA 条带,且28s RNA 亮度是18s 亮度的1.5～2.0倍。RTPCR 为两步法。逆转录总体系20μl ,其中细胞总RNA 1μg。30℃10min ,42℃30min 合成第一条cDNA 链,99℃5min 灭活AMV 逆转录酶。PCR 反应体系为50μl 。survivin 上游引物：5′TTCATCCACTGCCCCACT3′；下游引物：5′CCTTTCCTAAGACATTGCTAA3′。 PCR 反应条件:94 ℃变性30s ,50℃退火30s ,72℃延伸90s,共32 个循环。

    βactin作为内参，引物为5′CGTGCGTGACATTAAGGAGA3′ ，下游引物5′CACCTTCACC GTTCCAGTTT3′，片段为233bp。

    1.5  Western blot检测survivin蛋白的表达  用细胞裂解液提取细胞胞浆蛋白，细胞裂解液主要成分为20 mM Tris (pH 7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X100，以及EDTA，EGTA，sodium pyrophossphate，βglycerophosphate，Na3VO4，leupeptin等。在使用前数分钟内加入PMSF至最终浓度为1mM。根据Bradford蛋白定量法进行蛋白定量。取20μg提取的蛋白质,经15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,恒压100V 1h 电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF) 印迹膜。BSA封闭1h后，加入兔抗人survivin 多克隆抗体（1∶200稀释）为一抗，在室温、摇床上结合2h；TBST洗膜后再用羊抗兔IgG（1∶1 000稀释）为二抗，TBST(TBS 中加入0.05% Tween20) 洗膜，用化学发光法显色。

    1.6  MTT法检测细胞增殖性

    0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的sursiRNA/SW480细胞、pRNAT/SW480细胞、SW480细胞后，用10%小牛血清培养液制成单细胞悬液(5×105个/ml)，接种于96孔培养板中（100μl/孔），培养24h更换上清液为无血清培养液，继续培养48h。每组各设6个孔，在终止培养前6h加入MTT(5mg/ml)10μl/孔，结束培养时加入20%SDS100 μl/孔，使结晶充分溶解，次日用酶联免疫标记分析仪测定每孔570nm波长的吸光度A值(A570)。按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率R=[1-(A实验组/A空白组)]×100%。

    1.7  细胞侵袭实验

    细胞体外侵袭能力的测定在12孔板Transwell小室中进行。Matrigel(BD PharMingen) 50μl用不含血清的DMEM培养基1∶1稀释，加入Transwell小室的聚碳酯膜上表面（12.0μm膜孔径），室温下通风橱中干燥1h。将surshRNA/SW480细胞、pRNAT/SW480、SW480细胞用PBS洗3次，消化后重悬于不含10％FCS的DMEM培养基中，取1×106/ml细胞500μl至上室，Transwell培养板下室加入1 000μl 含10％FCS的DMEM培养液。37℃、体积分数5％CO2条件下培养24h，4％福尔马林固定后行Gimsa染色。去除滤膜上层细胞，用中性树脂将膜封于载玻片上。镜下（×400）计数滤膜下表面的侵袭了基底膜的细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复3次，实验重复3次，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

    1.8  统计学方法

    采用t检验，数据采用±s表示，用SPSS11.5软件进行统计处理。

    2  结果

    2.1  成功地构建了pRNAT/sursiRNA表达质粒

    siRNA的插入序列为76bp,两端为BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位点，经测序序列与设计序列完全相符，见图2，pRNAT/sursiRNA表达质粒转染大肠癌细胞株SW480细胞后，细胞胞浆中出现绿色荧光，说明pRNAT/sursiRNA表达质粒正确表达。

    2.2  survivin mRNA 和蛋白的表达

    RTPCR 结果显示SW480细胞株高表达survivin mRNA，pRNAT/sursiRNA转染SW480 细胞后survivin mRNA受到明显的抑制，图像分析示抑制达到80％，见图3a。Western blot 结果显示survivin蛋白的表达受到明显的抑制，与对照组相比survivin 蛋白表达明显下降达85％，见图3b。表明pRNAT/sursiRNA能有效的抑制survivin mRNA表达，进而导致survivin 蛋白表达下降。

    2.3  MTT法检测细胞增殖性

    sursiRNA/ SW480细胞、对照组（pRNAT/SW480）、SW480细胞在570nm处的吸光光密度OD值及增殖抑制率，见表1。可见sur siRNA对SW480细胞增殖呈明显的抑制作用，达37.4％，与对照组相比有明显的统计学意义(P<0. 01)。

    2.4  细胞侵袭能力

    在镜下观察扫描全膜，随即取5个视野的sursiRNA/SW480细胞、pRNAT/SW480细胞、SW480表1  pRNAT/sursiRNA对SW480细胞增殖的影响 #:P<0.01细胞的细胞穿透数分别为153±66、505±65、578±98个，说明pRNAT/SursiRNA沉默survivin基因后，SW480细胞的穿透数明显降低即细胞侵袭能力降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），见图4。

    3  讨论

    RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象广泛存在于生物界，从低等的原核生物到人类均已有发现。是指由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）介导的特异性同源基因mRNA降解的一种细胞反应过程，是转录后的基因沉默［4］。由于RNA干扰抑制靶基因的特异性和效率均较反义核 苷酸高10倍以上，目前RNAi广泛应用于肿瘤基因治疗领域［5，6］。survivin 是凋亡抑制蛋白(Inhibition Apoptosis Protein, IAP)成员之一，具有强大的抗细胞凋亡作用，并在维持细胞有丝分裂及血管形成调控过程中起重要作用［7］，在结直肠癌的致病过程中起重要作用[1,8] 。本研究观察了采用RNA干扰技术沉默survivin基因后大肠癌细胞株SW480细胞生物特性的变化。本研究根据survivin基因序列，设计、合成了针对survivin mRNA的特异性RNA干扰片断，并克隆入pRNAT U6.1/Neo载体，构建了survivin shRNA真核表达质粒（pRNAT/ SursiRNA）。测序验证及pRNAT/ sursiRNA重组质粒转染SW480细胞后绿色荧光蛋白的表达皆证实构建的pRNAT/surshRNA重组质粒的正确性。通过脂质体介导将pRNAT/surshRNA和空载体pRNAT分别转染入大肠癌细胞株SW480，通过G418筛选，建立了稳定转染pRNAT/sursiRNA的 SW480细胞系，RTPCR研究证实survivin mRNA的表达下调85％及Western blot分析证实survivin蛋白表达下调80％，sursiRNA 成功地抑制了survivin的表达，稳定转染pRNAT/SursiRNA的 SW480细胞系的建立，为进一步研究survivin基因对大肠癌细胞生物特性的影响提供了的物质基础。

    本研究表明沉默SW480细胞survivin基因后，肿瘤细胞的增殖明显降低。其机制可能是survivin基因的表达主要在G2/M期，可竞争性地与Cdk4/p16INK4a复合物结合，形成survivin /Cdk4复合物，把p16INK4a复合物从复合物中解离出来，从而激活Cdk2/Cyclin E，导致Rb蛋白磷酸化，引起有丝分裂和细胞的增殖。当survivin蛋白下调后，G1期细胞增加，而S期细胞减少，因此细胞增殖性降低［9］。

    侵袭性是恶性肿瘤的重要生物学特征，抑制肿瘤细胞的侵袭对于肿瘤的临床治疗具有深远的意义。研究发现，SW480细胞的survivin被沉默后，SW480细胞的侵袭能力明显降低，这提示survivin表达与大肠癌细胞侵袭性有关。其可能的机制是survivin被沉默后细胞阻滞在G2/M期，影响微管、微丝的装配［10］，SW480细胞在微管结构改变的情况下，可能引起细胞粘弹性系数下降，进而引起细胞侵袭下降。另外抑制survivin表达可以降低肿瘤的血管生成，进而抑制SW480细胞的侵袭［11,12］。总之针对survivin基因的siRNA可能是治疗大肠癌有效的方法。  

【参考文献】［1］ Kim PJ,Plescia J,Clevers H,et al. Survivin and molecular pathogenesis of colorectal cancer[J].Lancet,2003,362(9379): 205209.

［2］ LaCasse EC, Baird S, Korneluk RG, et al. The inhibitors of apoptosis (IAPs) and their emerging role in cancer [J]. Oncogene, 1998,17(25): 32473259.

［3］ Zaffaroni N,Pennati M, Daidone MG. Survivin as a target for new anticancer interventions[J]. J Cell Mol Med,2005,9(2):360372 .

［4］ Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans [J].Nature,1998，91(6669):806811.

［5］ Hannon G J.RNA interference[J].Nature，2002，418（6894）:244251.

［6］ Cerutti H.RNA interference:traveling in the cell and gaining functions?[J].Trends Genet，2003，19（1）:3946.

［7］ Singhal S, Vachani A, AntinOzerkis D, et al.Prognostic implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis biomarkers in nonsmall cell lung cancer: a review[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(11): 39743986.

［8］ Ponnelle T, Chapusot C, Martin L, et al. Cellular localisation of Survivin: impact on the prognosis in colorectal cancer [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2005,131(8): 504510 .

［9］ Kawasaki H, Toyoda M, Shinohara H, et al. Expression of survivin correlates with apoptosis, proliferation, and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis[J].Cancer,2001,91(11): 20262032.

［10］Yang D, Welm A, Bishop JM. Cell division and cell survival in the absence of survivin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004 ,101(42):1510015105.

［11］Ryan BM, Konecny GE, Kahlert S, et al. Survivin expression in breast cancer predicts clinical outcome and is associated with HER2, VEGF, urokinase plasminogen activator and PAI1[J]. Ann Oncol, 2006,17(4):597604.

［12］Beierle EA, Nagaram A, Dai W, et al. VEGFmediated survivin expression in neuroblastoma cells[J].J Surg Res, 2005,127(1): 2128.