阿霉素纳米粒对人白血病多药耐药细胞株 HL60/ADR多药耐药性的逆转作用

    作者：王磊，柯 红，任东明，王一羽    作者单位：1. 湖北宜昌，三峡大学医学院；2. 葛洲坝中心医院肿瘤科     【关键词】  阿霉素；聚氰基丙烯酸异丁酯；纳米粒；多药耐药；逆转

    肿瘤细胞产生药物耐受是导致临床化疗失败的主要原因，其中多药耐药(multidrug resistence,MDR)是肿瘤产生药物耐受的最重要机制[1]。化疗是治疗白血病的首选方法，白血病具有易复发和产生MDR的生物学特性，加强白血病MDR逆转研究具有重要意义。载体系统(微球、脂质体、纳米粒)逆转MDR是有效策略之一[24]，本实验以阿霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒（adriamycinloaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles ADRPIBCANP）逆转人白血病多药耐药细胞株HL60/ADR的MDR，观察其逆转效果、研究其可能机制。

    1  材料和方法

    1.1  药物和试剂  阿霉素和MTT为Sigma公司产品，RPMI1640培养基和小牛血清为Gibco公司产品，其余试剂均为分析纯。

    1.2  阿霉素纳米粒的制备  称取66.5 mgαIBCA单体（α氰基丙烯酸异丁酯单体）在电磁搅拌下缓缓滴入含阿霉素5 mg、5%葡萄糖、1%右旋糖酐70、0.5%柠檬酸的溶液中，室温下搅拌6 h完成乳液聚合作用，2 ml分装，除少量备检测，其余冷冻干燥36 h后封口，保存在4℃备用。同法制备空白纳米粒(即不含阿霉素的纳米粒)。

    1.3  纳米粒形态及粒径观测  取纳米粒3瓶，每瓶加蒸馏水2 ml,吹打分散，以3%磷钨酸负染后以透射电镜摄片观察形态并测量粒径及分布,每片计数测定200粒以上，数据行统计学分析。

    1.4  包封率测定  取纳米粒两瓶，其一以DMSO：H2O(3∶1)溶解后，以荧光分光光度法测量阿霉素488 nm处荧光值计为总药量(WT)，另取一瓶加蒸馏水2 ml,吹打分散，经低温高速离心（4℃、4 000转/分）2 h后分离上清液，同法测定游离药物量(WF)。

    包封率=WT-WFWT×100%

    1.5  细胞株及培养条件  人白血病细胞株HL60/ADR为本室保种，在ADR 0.05 μg/ml，10%小牛血清RPMI1640培养液中稳定生长。试验前两周换用无ADR的RPMI1640培养液培养。

    1.6  MTT法药物敏感实验  对数生长期肿瘤细胞悬液2×103·well1，接种于96孔板，实验分四组，即阿霉素组、阿霉素纳米粒组、对照组和空白组，阿霉素组和阿霉素纳米粒组每孔加不同浓度ADR，对照组加等剂量溶剂，空白组不加细胞仅加等剂量溶剂。每个浓度重复4孔，置5％CO2，37℃培养72 h后每孔加2 g·L1 MTT 25μl，37℃培养4 h后终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10分钟使结晶物充分溶解。用酶标仪测OD570。

    抑制率=(1药物组OD/对照组OD)×100%

    1.7  流式细胞术测定细胞内药物浓度  对数生长期肿瘤细胞悬液2×106个/ml，离心，PBS洗一次，用无血清的RPMI1640培养液悬浮，实验分三组，即阿霉素组、阿霉素纳米粒组和对照组，阿霉素组和阿霉素纳米粒组ADR终浓度均为2 μmol/L，对照组不加ADR。37℃温育1 h，然后洗去药物，台盼篮染色活细胞数大于97％。细胞过滤后，流式细胞仪测定细胞内阿霉素相对荧光强度（激发波长488 nm，发射波长575 nm），以阿霉素相对荧光强度代表阿霉素浓度。

    1.8  统计学方法  两均数比较的t检验。

    2  结果

    2.1  形态及粒径观察  合成物透射电镜下呈球型,颗粒状，无粘连，平均粒径98.5±3.67 nm（图略）。

    2.2  阿霉素包封率为95%。

    2.3  MTT法药物敏感实验  空白纳米粒在高浓度时（100 μg/ml）可明显抑制肿瘤细胞增殖，在低浓度时（10 μg/ml）对肿瘤细胞增殖无抑制作用，说明纳米材料的细胞毒作用对MTT实验的影响可忽略不计。阿霉素纳米粒和阿霉素对HL60细胞细胞毒作用相似；而对于HL60/ADR，在任何一个浓度点，阿霉素纳米粒较阿霉素毒性明显增强，其逆转倍数为IC50(ADR)/ IC50(ADRPIBCANP)=2.63倍。

    2.4  细胞内阿霉素浓度  阿霉素纳米粒组和阿霉素组，在HL60细胞内ADR浓度相似（P>0.05）；而在HL60/ADR细胞内，则阿霉素纳米粒组的ADR浓度明显高于阿霉素组，约为阿霉素组的1.48倍。

    3  讨论

    纳米粒作为纳米级载体系统，可以有效保护药物、具有控制释放和靶向释药等特点，从而显著提高疗效，降低毒副作用而成为药学研究的热点之一。现阶段纳米粒在人体中吸收和药效学研究几乎空白，纳米粒的作用机制也有较多争议，所以进一步深入研究十分必要。由于纳米粒制备条件要求较高、尚未成为商品制剂等因素，在国内通常难以获得，从而影响了纳米研究的开展。

    纳米粒的制备方法主要包括复乳法、吸附法、溶剂非溶剂法、乳化冷冻融化法[5]等。纳米材料的选择分为生物降解型如聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙交酯、聚氰基丙烯酸烷酯等和非生物降解型如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚酰胺等。由于生物降解材料在降解的同时伴随药物释放，而且其高分子材料在体内水解酶作用下最终生成水和二氧化碳，其应用较非生物降解型日益广泛。包封物可为肽类和蛋白类药物化疗药物等。本实验室参考国外文献，在药学院协助下，以乳液聚合法合成了阿霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒（adriamycin loaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles ADRPIBCANP）。乳液聚合法主要利用表面活性剂使聚合物单体乳化成纳米大小的液滴，然后使单体聚合成高分子聚合物（本实验中是利用氢氧根离子使之聚合）。检测显示，纳米粒呈球形颗粒，平均粒径在100nm 以下，阿霉素包封率为95%，与国外文献所述相当，符合实验要求，为纳米粒的进一步研究提供了良好的条件。

    肿瘤细胞对抗癌药产生多药耐药（MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因，逆转MDR是肿瘤研究的热点之一。逆转策略包括药物的化学修饰[6] 、化疗增敏剂应用等[7]。Soma CE [8]和Barraud L [9]研究显示包裹阿霉素的聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒可以有效逆转肿瘤细胞MDR，机制为避开多药耐受糖蛋白（PgP）的作用。Laurand A [10]研究发现聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒可以逆转白血病细胞系K562的MDR，提高细胞内药物浓度为其逆转机制之一。Barraud L [11]进一步研究认为，PIBCA阿霉素纳米粒逆转MDR是通过改变细胞膜的某些特性而非直接作用于PgP。

    纳米粒可以逆转肿瘤细胞的MDR，已有多篇文献报道，但均为PgP介导的MDR，未见针对MRP的逆转试验报告。诸多研究显示，MRP既可以单独介导，亦可以参与介导白血病的MDR。本实验结果显示：ADRPIBCANP组对HL60/ADR的细胞毒作用是ADR组的2.63倍，ADRPIBCANP组在HL60/ADR细胞内ADR的浓度是ADR组的1.48倍。ADRPIBCANP可以有效逆转MRP介导的MDR，显著增高的细胞内ADR浓度为其机制。细胞内药物的增加，Mo Y等[12]认为是通过胞吞作用进入细胞避开膜泵外排效应， Chavanpatil MD [13] 则分析为大量药物扩散到细胞内饱和了PgP的外排。尽管是否存在其他机制尚待进一步研究，但我们的研究结果是确定的：HL60细胞对ADR和ADRPIBCANP敏感性相似，ADRPIBCANP对HL60/ADR的细胞毒性大于ADR。有研究显示MRP与PgP有部分相似性，但前者还可影响GSH/GST系统，且可促进药物在细胞内重新分布而离开作用靶点[14],所以不排除其他机制参与的可能性。

    纳米粒作为药物的纳米级载体系统，由于其良好的可控性释放、可改变药动学参数、在一定程度上可以有效穿透生物屏障而具有深入研究的重要意义，而其材料选择范围广，制备方法多样又给进一步研究提供了可能性。

    尽管纳米粒在注射、口服、局部用药等方面尚有较多问题需要解决，但其广泛的应用前景是显而易见的。随着医药工业的发展，有望不断研制出新的、安全的，有临床应用前景的载体材料；同时，载体作用机制，载体材料与药物的相互作用方式必将得到更深入、广泛的研究。

【参考文献】[1]  Stein WD, Bates SE, Fojo T. Intractable cancers: the many faces of multidrug resistance and the many targets it presents for therapeutic attack[J]. Curr Drug Targets, 2004,5(4):333346.

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[11]Barraud L, Merle P, Soma E, et al. Increase of doxorubicin sensitivity by doxorubicinloading into nanoparticles for hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J]. J Hepatol, 2005,42(5):736743.

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