CXCR4/ SDF1α对宫颈癌HeLa细胞定向迁移及增殖的影响

    作者：张建平,吕卫国,谢 幸    作者单位：1. 苏州大学附属一院妇产科；2.浙江大学附属妇产科医院妇瘤科     【摘要】  目的 了解CXCR4在HeLa细胞的表达情况，并借助细胞培养评价CXCR4/ SDF1α对HeLa细胞定向迁移及增殖的影响。方法 CXCR4 mAb免疫染色HeLa细胞。用Transwell侵袭转移模型评价HeLa细胞的迁移情况，其中，上室中加入预先用（或不用）CXCR4单抗预孵育的HeLa细胞，下室中加入含0～100ng/ml SDF1α的培养基。为评价CXCR4、SDF1α对HeLa细胞增殖的影响，将HeLa细胞接种于有(无)SDF1α和（或）CXCR4的低血清环境72h。结果 CXCR4在所有HeLa细胞上均有表达。HeLa细胞能顺SDF1α浓度差定向迁移，且这一作用可被CXCR4 mAb拮抗。SDF1α能促进HeLa细胞在低血清环境中增殖。结论 CXCR4/ SDF1α参与了HeLa细胞定向迁移的过程并影响其增殖。

    【关键词】  HeLa细胞株；定向迁移；增殖；CXCR4；SDF1α

     Effect of CXCR4/ SDF1α in Derected Migration and Proliferation of HeLa Cells

    ZHANG Jianping1,LV Weiguo2,XIE Xing2

    1.Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated  Hospital  of Suzhou University,Suzhou 215006,China;2.Department of Gynecologic Oncology,Women’s Hospital,School of Medicine,Zhejiang UniversityAbstract：Objective   To investigate the expression of CXCR4 in HeLa cells,and evaluate the effect of CXCR4/ SDF1α in directed migration and proliferation of HeLa cells.Methods  HeLa cells were immunohistochemically stained with mouse antiCXCR4 monoclonal antibody (mAb).In vitro invasion of HeLa cells was evaluated using Transwell Permeable Supports,in which HeLa cells with/without CXCR4 mAb preincubation were seeded in the upper chambers,medium containing 0～100ng/ml of SDF1α was added to the lower compartments.For evaluating the effect of CXCR4/ SDF1α on proliferation of cervical cancer cells,HeLa cells were cultured for 72 hours exposed to SDF1α with and without CXCR4 mAb.Results  CXCR4 was expressed on all HeLa cells.SDF1α induced the directed migration of HeLa cells with a concentrationdepended model,which was inhibited by using CXCR4 mAb.SDF1α also stimulated the proliferation of HeLa cells mediated by CXCR4.Conclusion  CXCR4/ SDF1α participate in the directed migration and proliferation of HeLa cells.

    Key words：HeLa cell line; Directed migration; Proliferation;CXCR4; SDF1α

     宫颈癌是全球妇女的主要健康问题之一。2002年Parkin等 [1]统计发现全球每年发生的宫颈癌约493 000例，每年死亡274 000例，是全球妇女的第三大常见肿瘤，其中约73%发生于发展中国家，在那里，宫颈癌是肿瘤死亡病例中的首位或第二大常见病因。淋巴结转移是最常见的转移途径，也是最重要的预后因素。许多肿瘤的研究均表明趋化因子SDF1α及其受体CXCR4与肿瘤的转移有关，而至今尚未对宫颈癌进行这方面的探讨，为此，我们用免疫组化的方法检测了宫颈癌HeLa细胞CXCR4的表达情况，同时用体外试验观察CXCR4和SDF1α对HeLa细胞迁移和增殖的影响，进而评价CXCR4/ SDF1α对HeLa细胞的影响。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    (1)宫颈癌细胞株：HeLa细胞（引自美国ATCC，www.atcc.org）;(2)鼠抗人CXCR4单抗、SDF1α：均购自美国R&D公司;(3)Transwell趋化转移盒购自英国Corning公司;(4)RPMI1640、15%FCS购自美国GibcoRBL公司；2mmol/L谷氨酰胺、0.01mol/L丙酮酸钠、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素、胰蛋白酶均购自Sigma公司。二步法试剂盒EliVisionTM，为Zymed公司产品，购自福建迈新公司。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞免疫组化

    为检测HeLa细胞CXCR4的表达情况，将消毒、硫化过的载玻片置入HeLa细胞培养孔的底部。培养72h后，HeLa细胞布满整个载玻片。取出HeLa细胞爬片，经PBS洗涤后，用2.5%戊二醛固定后，用鼠抗人CXCR4单抗（1∶100）对它进行二步法免疫组化染色。

    空白对照以PBS代替一抗。

    1.2.2  体外细胞趋化转移模型分析

    Transwell趋化转移盒，由24孔培养小室组成，小室直径为8mm，内含小提蓝，小提蓝的底为一层6.5mm直径的多聚碳合物的多孔渗透膜，膜厚10μm，表面积为0.33cm2，每平方厘米膜上有1×105个孔，每个孔的孔径为8μm。这样转移盒就分成了小提蓝内的上室和小提蓝与培养小室间的下室。微孔多聚碳合物膜包被细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）蛋白，使上、下室彼此分离。这层渗透膜封闭了网眼，阻止非浸润转移性细胞的迁移，但可允许趋化因子穿过这层膜去激活肿瘤细胞。浸润转移的肿瘤细胞可迁移入这层膜内并穿透这层膜而附着于膜下层。

    首先向下室加入0.6ml的含10%FCS的RPMI1640培养液，内含0～100ng/ml的SDF1α。然后插入小提蓝，再将HeLa细胞用RPMI1640培养基调节成5×105 cells/ml的浓度，向小提蓝的上室内加入0.1ml HeLa细胞（含5×104个细胞）。在37℃、5% CO2的培养箱中培养24h后，用棉签擦去膜上方表面的HeLa细胞，紧贴上室边缘剪切下渗透膜，并用苏木素伊红染色。由2名不知情的病理学家在10个高倍镜视野(×200)下计数嵌于孔中或附着于膜下方的细胞。在中和试验的研究中，HeLa细胞与20μg/ml CXCR4 mAb预孵育24h后才加入转移模型的上室。每种情况重复3次。

    1.2.3  SDF1α对HeLa细胞增殖的影响

    为评价SDF1α对HeLa细胞增殖的影响，用低血清RPMI1640培养基（0.5%FCS）设计出4种情况：含或不含100ng/ml SDF1α；同时含或不含20ng/ml CXCR4 mAb。然后将2 ×104 HeLa细胞分别接种于这4种情况的培养基中，培养72h（细胞能长满而不发生生长抑制），再用胰蛋白酶消化后吸取细胞进行计数。每种情况均重复3次，同一条件下的3孔细胞数取均值。

    1.3  统计学方法

    不同组间均数的比较用SPSS 11.5软件包的OneWay ANOVA分析，两组均数间的比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  HeLa细胞的免疫组化结果

    所有HeLa细胞的细胞膜和细胞浆均有CXCR4的表达，见图1。

    2.2  SDF1α对HeLa细胞迁移的影响

    SDF1α对HeLa细胞有浓度依赖性的化学趋化作用，最大反应剂量为100ng/ml，见图2。这种趋化反应在HeLa细胞与CXCR4 mAb预孵育后受到抑制，提示SDF1α对HeLa细胞的化学趋化作用是通过CXCR4介导完成的。

    2.3  SDF1α对HeLa细胞增殖的影响  

    在有100ng/ml SDF1α的情况下，与空白对照组相比，HeLa细胞培养72h后，细胞数平均增加112.3%；与有CXCR4 mAb组相比，细胞数平均增加151.3%，见图3。提示SDF1α的细胞增殖作用能被CXCR4 mAb部分抑制。

    3  讨论

    趋化因子是一类有趋化活性的细胞因子，分子量较小，约7～15kDa，在炎症反应中参与调节白细胞黏附、穿越脉管内皮细胞，进而扩散到组织间隙的过程[2]。根据趋化因子氨基端保守胱氨酸序列的不同，可将其分为四大家族：CC,CXC,C和 CX3C，其中，CC家族氨基端的2个胱氨酸残基紧密相邻，而CXC家族氨基端的2个胱氨酸残基之间有另外一种氨基酸相分离。趋化因子通过结合靶细胞膜上的相应受体而发挥生物学效应。趋化因子受体属于有 7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体超家族。至今至少已发现存在5种CXC的受体[3]。趋化因子与其受体的细胞外氨基端结合后，导致该受体细胞浆内羧基端的丝氨基或苏氨酸残基磷酸化，进一步产生其他的生物学效应。

    免疫反应及炎症反应的过程中，趋化因子及其受体能有效地调节白细胞的趋化活性和渗出过程[4]。已有研究表明趋化因子受体是以一种独特的、非随机的方式存在于肿瘤细胞的细胞膜及细胞浆，如乳腺癌[5]、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、脑癌、肺癌和甲状腺癌。肿瘤细胞表达趋化因子受体，肿瘤扩散转移的部位表达它们的配体[57]，提示肿瘤转移并非是一随机事件，更有可能似白细胞顺趋化因子浓度差而迁移的过程。尽管不同的肿瘤细胞表达不同的趋化因子受体，但最常见的、表达于人类肿瘤细胞的趋化因子受体是CXCR4，后者在至少23种人类肿瘤细胞上均有表达 [8]。

    CXCR4在肿瘤细胞表面表达，可能会促进肿瘤细胞向靶器官主动性、定向性转移[9]。CXCR4只能被它唯一的配体——间质细胞衍生因子1α（stromalcellderived factor1α，SDF1α）激活。CXCR4的激活会启动肿瘤细胞的信号传导途径，后者对肿瘤转移十分重要，如细胞骨架重排、肌动蛋白聚合 [5]、伪足形成、与内皮细胞紧密黏附、定向性迁移、细胞繁殖等。我们用免疫组化的方法评价HeLa细胞的CXCR4表达情况，结果显示：所有的HeLa细胞均表达CXCR4，提示CXCR4可能会成为HeLa细胞定向迁移的基础。

    肿瘤浸润和转移是一复杂的过程，其中肿瘤细胞穿透脉管基底膜和内皮细胞层是肿瘤细胞浸润转移到靶组织的重要过程。通过激活CXCR4促使肿瘤细胞定向转移呈现SDF1α浓度依赖性[10，11]。已有报导表明， SDF1α在浓度为100～1000ng/ml时表现出最佳的刺激单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞和肿瘤细胞的迁移效果。应用实时监测单个细胞运动情况的方法，发现SDF1α能加速某些人类肿瘤细胞的运动能力，如：乳腺癌细胞、横纹肌细胞和小细胞肺癌[10，12]。SDF1α对肿瘤细胞活动能力的影响机制包括：细胞骨架蛋白的改变或重排、肌动蛋白束数量的增多和厚度的增加、钙内流增加等。本研究借助于肿瘤侵袭转移模型，显示出HeLa细胞对趋化因子SDF1α表现出浓度依赖性的定向迁移，最大反应浓度为100ng/ml。同时发现，CXCR4 mAb能抑制SDF1α对HeLa细胞的这种促迁移作用。提示SDF1α能浓度依赖性地诱导体外HeLa细胞的定向迁移，且这一过程是通过CXCR4介导实现的。

    SDF1α除了能促进肿瘤细胞的迁移，还参与肿瘤细胞的生长和存活。SDF1α能促进表达CXCR4的肿瘤细胞增殖，能促使这些肿瘤的肿瘤细胞在不利的生存环境中生存，如低血清浓度的环境。这些肿瘤有胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌和小细胞肺癌[1316]。肿瘤细胞远处转移时，如无足够的血供，将较难生存繁殖，但SDF1α可能有助于肿瘤细胞的生存和增殖。对HeLa细胞的体外研究表明SDF1α有促进HeLa细胞增殖的特性，而CXCR4 mAb能削弱这种效果，提示CXCR4参与了SDF1α促进HeLa细胞增殖的过程，SDF1α有助于HeLa细胞在低血清的不利环境中增殖。

    总之，CXCR4 mAb能抑制SDF1α对HeLa细胞的迁移效果，SDF1α对HeLa细胞的增殖作用也可能是通过CXCR4而起作用的，提示CXCR4可作为抑制宫颈癌细胞转移的作用靶点。已报导有两种小多肽AMD3100 和T22是CXCR4的高选择性的抑制剂，并正在进行临床试验[17]。同时也有研究表明，阿斯匹林等非甾体类消炎解热镇痛药能有效地抑制肿瘤细胞的转移[18]，这可能与其能抑制趋化因子的产生有关。目前仍需更多的研究来探讨这些特异性的CXCR4抑制物是否能抑制宫颈癌的淋巴结转移。

【参考文献】［1］ Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002［J］.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74108.

［2］ Homey B,Muller A,Zlotnik A.Chemokines: agents for the immunotherapy of cancer? ［J］.Nat Rev Immunol,2002,2(3):175184.

［3］ Zlotnik A,Yoshie O.Chemokines: a new classification system and their role in immunity［J］.Immunity,2000,12(2):121127.

［4］ Camacho SA,Heath WR,Carbone FR,et al.A key role for ICAM1 in generating effector cells mediating inflammatory responses［J］.Nat Immunol,2001,2(6):523529.

［5］ Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature,2001,410(6824):5056.

［6］ Balkwill F.Chemokine biology in cancer［J］.Semin Immunol,2003,15(1):4955.

［7］ Florio T,Casagrande S,Diana F,et al.Chemokine stromal cellderived factor 1alpha induces proliferation and growth hormone release in GH4C1 rat pituitary adenoma cell line through multiple intracellular signals［J］.Mol Pharmacol,2006,69(2):539546.

［8］ Balkwill F.The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4［J］.Semin Cancer Biol,2004,14(3):171179.

［9］Narducci MG,Scala E,Bresin A,et al.Skin homing of Sezary cells involves SDF1CXCR4 signaling and downregulation of CD26/dipeptidylpeptidase Ⅳ［J］.Blood,2006,107(3):11081115.

［10］Libura J,Drukala J,Majka M,et al.CXCR4SDF1 signaling is active in rhabdomyosarcoma cells and regulates locomotion,chemotaxis,and adhesion［J］.Blood,2002,100(7):25972606.

［11］Hwang JH,Chung HK,Kim DW,et al.CXC chemokine receptor 4 expression and function in human anaplastic thyroid cancer cells［J］.J Clin Endocrinol Metab,2003,88(1):408416.

［12］Adams GB,Chabner KT,Foxall RB,et al.Heterologous cells cooperate to augment stem cell migration,homing,and engraftment［J］.Blood,2003,101(1):4551.

［13］Zhou Y,Larsen PH,Hao C,et al.CXCR4 is a major chemokine receptor on glioma cells and mediates their survival［J］.J Biol Chem,2002,277(51):4948149487.

［14］Scotton CJ,Wilson JL,Scott K,et al.Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer［J］.Cancer Res,2002,62(20):59305938.

［15］Sun YX,Wang J,Shelburne CE,et al.Expression of CXCR4 and CXCL12 (SDF1) in human prostate cancers (PCa) in vivo［J］.J Cell Biochem,2003,89(3):462473.

［16］Barbero S,Bonavia R,Bajetto A,et al.Stromal cellderived factor 1alpha stimulates human glioblastoma cell growth through the activation of both extracellular signalregulated kinases 1/2 and Akt［J］.Cancer Res,2003,63(8):19691974.

［17］Donzella GA,Schols D,Lin SW,et al.AMD3100,a small molecule inhibitor of HIV1 entry via the CXCR4 coreceptor［J］.Nat Med,1998,4(1):7277.

［18］Ulrich CM,Bigler J,Potter JD.Nonsteroidal antiinflammatory drugs for cancer prevention: promise,perils and pharmacogenetics［J］.Nat Rev Cancer,2006,6(2):130140.