裸小鼠人大肠癌淋巴道转移模型的建立

    作者：涂经楷，傅仲学，王春毅，吴星烨,李明洋,李尚坤    作者单位：重庆医科大学附属第一医院普外科     【摘要】  目的 建立一种人大肠癌简便、可行、稳定的淋巴道转移研究动物模型。方法 裸鼠爪垫皮下注射人结肠癌HCT116细胞，接种后在1～6周及8周不同时间段取材；收集腹股沟、腘窝，髂血管旁，肾门淋巴结以及肝肺脏器；进行HE染色及CEA免疫组化检测。观察种植瘤的成瘤率、生长情况以及淋巴结转移规律。结果 爪垫种植1周后成瘤率100％。3周后淋巴结开始转移，到6周时第一级腹股沟腘窝淋巴结完全转移，转移率100％，其中腹股沟淋巴结转移阳性率76.9%(10/13)；第二级髂血管旁淋巴结部分转移，转移率40％（2/5）；未见第三级肾门淋巴结转移。到8周时见髂血管旁淋巴结转移率60％(3/5)，肾门淋巴结开始转移(1/5)，但均未见肝肺远处转移。HE染色及CEA免疫组化染色发现淋巴结有弥漫性癌细胞浸润。结论 裸鼠爪垫皮下注射可成功建立人大肠癌淋巴道转移模型。此模型快速简便、转移集中、转移率高，可为研究结直肠癌淋巴道转移机制，药物干预等抗转移治疗提供理想的动物模型。

    【关键词】  人结直肠癌;淋巴道转移;裸鼠模型

    Establishment of Human Colorectal Cancer Lymphatic Metastasis Model in Nude Mice

    TU Jingkai,FU Zhongxue,WANG Chunyi,WU Xingye,LI Mingyang,LI Shangkun

    Department of General Surgery,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

    Corresponding Author:FU Zhongxue,Email:fzx990521@sina.comAbstract：Objective   To establish the simple,viable and stably nude mice model of lymphatic metastasis using human colorectum tumor.Methods  The lymphatic metastasis nude models were established by injecting colorectum tumor HCT116 cell line into the nail pad.Detect the formation rate,growing condition and metastasis regularity,collect the drain part at different moments on weeks 1～6,and 8 after tumor implantation in different bathes,including groin popliteal fossa,iliobloodvessel side,renal hilum lymph node and the distant organ.Then detect the HE dyeing and immunohistochemistry stain of CEA.Results  The formation rate is 100% after 1 week.Generate metastasis 3 weeks later.Until inject tumor cells 6 weeks later,groin popliteal fossa lymph nodes metastasis rate is 100%,including 76.9％（10/13）of groin lymphatic metastasis; iliobloodvessel side metastasis rate is 40%(2/5);no finding in renal hilum lymph node metastasis.In 8th week iliobloodvessel side lymph nodes metastasis rate is 60%(3/5),renal hilar lymph node generate metastasis,but no finding metastasis in liver,lungs.Detected diffuse cancer cell metastasis in lymph nodes using HE dyeing and immunohistochemistry stain of CEA.Conclusion  The human colorectal cancer simple lymphatic metastasis model can be successfully established through the Claw pad hypodermic in nude mice.The model is simple,rapid,concentrated transfer and high rate transfer.It is an ideal animal model for colorectal cancer study lymphatic metastasis mechanism and antidrug intervention transfer therapy.

    Key words：Human colorectal cancer;  Lymphatic metastasis ;  Nude mouse model

    0引言

    大肠癌治疗失败的愿因在于肿瘤的复发和转移[1],而转移是患者的主要致死原因。在结直肠癌的浸润转移中，淋巴结转移又是早期最常见的转移方式，且淋巴结转移灶可以成为进一步血道转移的桥头堡[2]。由于缺乏结直肠癌单纯的淋巴道转移模型，所以对结直肠癌淋巴转移机制的研究难以突破。目前，国内、外关于单纯淋巴道转移研究模型少见报道，结直肠癌爪垫移植模型更是鲜见报道。针对裸鼠爪垫有着丰富的淋巴管和单向淋巴回流途径这一特点，本实验采用将人结肠癌细胞系接种于裸鼠爪垫皮下，建立了人大肠癌裸鼠淋巴道转移模型，旨在为结直肠癌淋巴转移机制和抗淋巴转移治疗的研究提供理想的动物模型。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  肿瘤细胞  人结肠癌细胞株HCT116，为低分化腺癌。由重庆医科大学附一院外科实验室提供。

    1.1.2  实验动物  BALB/c nu/nu裸小鼠35只，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物合格证：SCXK20070001）雄性，鼠龄4～6周，体重18g左右。

    1.2  方法

    1.2.1  人结肠癌细胞HCT116细胞株的复苏与培养  将冻存的人结肠癌HCT116细胞株（本实验室提供）从液氮罐中取出后，迅速放入37℃温水中复苏，并加入含10％新生小牛血清的RMPI1640细胞培养液进行培养，台盼蓝染色进行活细胞计数，活细胞数＞95％用于裸鼠爪垫注射建模。

    1.2.2  人结肠癌淋巴道转移裸小鼠移植模型的建立  将HCT116对数生长期的细胞制成细胞浓度为1×108 个/ml的细胞悬液，实验动物以1％氯胺酮0.3ml/只腹腔麻醉，5min后消毒裸鼠右后肢爪垫皮肤，将0.04ml(4×106个)的HCT116细胞悬液用2号针头缓慢注射于裸鼠右后肢爪垫皮下，见局部形成隆丘后退针。接种方法，见图1a。

    1.2.3  观察项目

    （1）肿瘤生长及淋巴道转移情况观察  定期观察爪垫肿瘤生长情况，全身状况，以及腘窝、腹股沟，腹腔等处淋巴结肿大转移情况。每周测量种植瘤块长短直径。肿瘤体积（mm3）=1/2×长×（宽）2，此目的在于研究肿瘤生长和淋巴结转移间的关系。35只裸鼠同时接种肿瘤细胞，每5只鼠在1～6周不同时间分批处死取材，另在接种后8周处死。完整解剖检查足垫淋巴引流各站淋巴结以及肝、肺等远处脏器转移情况。收集种植瘤块；腘窝、腹股沟，髂血管旁，肾门淋巴结以及肝、肺等组织；放置在10％福尔马林中固定，室温保持24 h后石蜡包埋，切片HE染色行组织学检查。

    （2）爪垫瘤块、转移淋巴结组织免疫组化检测人CEA。试剂购于中杉生物公司的浓缩型兔抗人CEA多克隆抗体及SP9001试剂盒，操作严格按照试剂盒流程。

    （3）动物成模标准的检测与方法  ① 肉眼观察：发现回流路径区域淋巴结肿大；② 淋巴结组织HE染色病检观察，确定转移的人结肠癌细胞；③ 接种瘤块、淋巴结转移灶组织人CEA检测阳性。

    1.3  统计学方法

    数据进行±s统计分析。

    2  结果

    2.1  裸小鼠接种生长情况  裸小鼠足垫接种瘤细胞15min后苏醒，活动如常。此接种技术无手术、术后死亡率及并发症。肿瘤细胞接种1w后肉眼见肿瘤结节生长，所有接种的肿瘤细胞在裸鼠爪垫注射部位全部成瘤，成瘤率100％，见图1b。在接种后不同时间测量肿瘤体积大小，肿瘤体积随接种时间生长，生长曲线见图2a。生长曲线表明肿瘤在3周后成指数生长，4周后部分瘤块开始发黑糜烂，6周时瘤块溃烂明显且几乎完全占据爪垫，瘤体生长趋于缓慢。

    2.2  人结肠癌裸小鼠爪垫种植后淋巴结转移情况  爪垫注射成瘤2周后可以在汇流的腹股沟区触及肿大的淋巴结，约米粒大小，质地偏硬，可以活动，有黏连感。4～6周后转移的淋巴结增大至绿豆或黄豆大小。淋巴结转移规律：（1）腘窝腹股沟LNM ：1～2周未见LNM；3周时转移发生，转移率40％（2/5），测量肿瘤体积(112±32)mm3；4、5周时转移率60％(3/5)；到6周时接种裸鼠均发生一级淋巴结转移，转移率100％，测量肿瘤体积(1460±370)mm3，其中腹股沟淋巴结阳性率76.9％（10/13）。（2）髂血管旁LNM：5周时转移发生，转移率20％(1/5)；6周时转移率40％(2/5)；8周时转移率60％(3/5)。（3）肾门LNM：6周前未见转移，8周时转移发生，转移率20％(1/5)。转移情况见图2b～d。并观察到淋巴结转移发生在肿瘤指数生长之前。解剖取材见转移淋巴结,图3a、b。

    2.3  病理组织学观察

    2.3.1  人结肠癌爪垫种植瘤形态学HE染色  组织切片表现为未分化癌，癌组织多呈圆形、椭圆形，核大畸形、深染，核分裂象多见，呈弥漫性生长。癌组织排列呈团状或索状，无明显腺体结构存在，呈浸润性生长,见图4a。

    2.3.2  淋巴结的形态学HE染色  肿瘤接种爪垫后转移淋巴结取材作HE染色在光镜下发现：在淋巴结的髓窦区域出现转移癌细胞形态异型性较大，呈圆形、椭圆形，核大畸形、深染，核分裂象多见，呈弥漫性和灶性浸润。此外，在髓窦区域以外的其他区域也有转移癌细胞浸润分布，见图4b。

    2.4  免疫组化分析  使用抗人CEA抗体显示种植瘤以及转移淋巴结中肿瘤细胞表达人CEA蛋白，提示种植瘤及转移灶从人结肠癌HCT116细胞得来，淋巴结浸润转移形成，见图5a、b。

    3  讨论

    人大肠癌与众多的恶性肿瘤一样，非常容易发生淋巴道转移，且时间较早。目前一些结肠肿瘤的实验动物模型被建立，但并没有针对结直肠肿瘤的淋巴道研究模型。我们通过在裸鼠爪垫注射人结肠肿瘤细胞，然后遵循其单向三级淋巴回流途径这一解剖学基础发生淋巴结转移，从而建立了一个有用的淋巴道转移研究模型。而以往用新鲜人结直肠组织和细胞系所建立的裸鼠皮下种植模型均不能发生深部浸润和转移[3]，脾内[4]、回肠系膜[5]或腹腔[6]注射人结直肠癌细胞系产生的肝转移灶模型，也只是血性转移过程，无淋巴道转移。目前广为应用的结直肠癌原位移植肝转移模型虽然既有肿瘤的原位生长，又有区域淋巴结肿大及肝转移灶形成等优点[7,8]，但腹腔区域淋巴结深在，腹腔转移广泛、弥散，难于淋巴道转移实验研究的控制和量化，也不利于实验观察和抗转移治疗的处理，更不便于结直肠癌单纯淋巴道转移的相关研究。为此，我们模型的优势在于：（1）肿瘤局部生长便于观察，利于干预因素的处理。（2）转移成单向性淋巴道转移且减少了影响因素，更适合单纯性淋巴道转移的研究。（3）操作简便可行且转移率高，可以满足大批量实验和推广应用。

    本实验着重观察了人结肠癌细胞在淋巴道转移的生物学特性和转移规律。我们在实验中，首先发现有肿大的淋巴结，其次常规的HE染色也发现有转移的上皮性癌细胞，转移的结肠癌细胞多聚集在淋巴结的髓窦区域，其他区域也有散在分布，生长方式表现为浸润性生长，转移癌细胞形态异型性较大，染色质深。镜下证实转移癌细胞存在，同时免疫组化检测结果显示肿瘤组织及转移灶人CEA蛋白表达，表明种植瘤及转移灶癌细胞均源于所种植的人类结肠癌细胞。因此，从不同层面上证实本研究模型是成功的。

    我们在实验中还采取不同时间取材初步观察了淋巴结转移情况及规律。而以往其他类型癌株的足垫移植模型文献，均未见转移规律及相关情况的研究报道。我们发现在裸鼠爪垫注射结直肠肿瘤细胞可以在局部形成肿瘤，以及继发淋巴结转移。在所有标本中第一站淋巴结转移充分,6周前主要集中在第一站，且转移率高，并且在转移形成中以腹股沟淋巴结转移阳性多见，而第二站、第三站转移率较低。这可能是观察转移时间不够以及与腹股沟淋巴结自身功能有关，机制尚待进一步研究。

    综上所述，本实验成功地构建了人结直肠癌裸鼠单纯淋巴道转移自发模型。操作简单，转移率高，转移灶表浅易于观察，且转移规律较集中，能够展现肿瘤浸润淋巴道转移的生物学特性和过程。这为进一步研究结直肠癌淋巴道转移机制，药物干预以及抗转移治疗提供了一种较理想的动物模型。

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