5脂氧合酶活化蛋白抑制剂MK886治疗裸鼠人结肠癌移植瘤的实验

    作者：周广军,朱小朝,时 坤    作者单位：江苏盐城市第一人民医院普外科     【摘要】  目的 观察5脂氧合酶活化蛋白（FLAP）抑制剂MK886对裸鼠人结肠癌移植瘤的治疗作用，并探讨其抗肿瘤的可能机制。方法 以HT29人结肠癌细胞制备裸鼠人结肠癌移植瘤模型，15只荷瘤裸鼠随机分为三组，治疗组以MK886溶解在二甲基亚砜中投药，两对照组分别给以二甲基亚砜及不作任何治疗。治疗期间观察肿瘤生长情况，治疗结束后处死裸鼠并取瘤，测量肿瘤体积重量，用免疫组化方法检测肿瘤微血管密度，用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果 15只裸鼠全部成瘤，且实验过程中无一裸鼠死亡；通过测量瘤体积、瘤重结果显示，MK886可抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长；实验还证实MK886对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤具有诱导肿瘤细胞凋亡及抗血管生成作用。结论 MK886对于裸鼠人结肠癌移植瘤具有明显的治疗效果，MK886可能通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤微血管形成等机制控制人结肠癌的生长。

    【关键词】  5脂氧合酶；抑制剂；裸鼠；结肠癌

    Efficacy of MK886 in Nude Mouse Model of Human Colonic Cancer

    ZHOU Guangjun,ZHU Xiaochao,SHI Kun

    Department of General Surgery,Yancheng First Hospital,Yancheng 224001,ChinaAbstract：Objective   To investigate the effect of the FLAP inhibitor,MK886 on human colonic cancer xenografts in vivo and to explore its potential antineoplasm mechanism.Methods  Cultured HT29 human colonic cancer cells were injected into the flanks of fifteen nude mice to develop xenograft models and the tumorbearing nude mice were randomized into three groups to be administered with MK886 dissolved into DMSO，DMSO only,nothing,respectively.The mice were monitored for 4 consecutive weeks for tumor volume changes.Then the tumor tissues was isolated and weighted,followed by pathological examination.The expression of 5LOX in tumor tissue was detected by immunohistochemistry and  apoptosis of colonic cancer cells was also detected by TUNEL.Results  None of the 15 nude mice died during the experiment and all nude mice formed in situ mass of colorectal tumor.MK886 inhibited growth of human HT29 colon cancer xenografts in athymic mice,measured as both tumor volume and tumor weight.The expression of 5LOX in tumor tissue of control group was stronger than that of treated groups.This test also confirmed the induction of apoptosis in colonic cancer cells and the function of inhibiting angiogenesis of tumor by MK886.Conclusion  5LOX inhibitor,MK886 inhibits the growth of colonic tumor by inducing the apoptosis of human colonic cancer cells and inhibiting the angiogenesis of tumor.

    Key words：5LOX;Inhibitor;Nude mouse;Colonic cancer

    类花生四烯酸（arachidonic acid,AA）的某些代谢产物在许多肿瘤的发生发展和转移中起着重要的作用。脂氧合酶（lipoxygenase,LOXs）作为介导花生四烯酸代谢某一途径的关键酶，可影响肿瘤的发生发展，因此LOX抑制剂越来越多地进入了肿瘤的研究与应用领域。自1969年Rygaard等首次成功在裸小鼠移植人结肠癌以后，人们开始利用裸鼠对人恶性肿瘤作了大量研究。因此，本实验以裸鼠为载体，选用5LOX高表达的人结肠癌HT29细胞株建立人结肠癌裸鼠皮下移植模型，旨在研究5LOX活化蛋白（FLAP）抑制剂(MK886)的抑瘤效果及其协同作用，并探讨其作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  细胞

    HT29人结肠癌细胞株，由中国科学院上海细胞库提供。

    1.2  实验动物

    15只SPF级裸小鼠，4～5周龄，体重16～20g，均为雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。均饲养于苏州大学SPF级实验动物中心。

    1.3  主要试剂和药物

    McCoy’5A培养基购自GiBco公司；TUNEL试剂盒由Roche公司提供；羊抗人5LOX多克隆抗体均由Cayman Chemical公司提供；二甲基亚砜由苏州大学第一附属医院血液研究中心提供；塞来昔布购自辉瑞制药有限公司；MK886购自Cayman Chemical公司。

    1.4  细胞培养与传代

    以下各项操作均在无菌细胞培养室的超净工作台中进行。人结肠癌HT29细胞于McCoy’5A培养基（含10%新生牛血清）中维持，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，细胞为单层贴壁生长，待贴壁细胞融合达70%～80%时以胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化传代。

    1.5  收集细胞并接种裸小鼠

    将处于对数生长期的细胞以胰酶消化后用无血清McCoy’5A培养液稀释成细胞悬液，离心、弃去上清，再以无血清McCoy’5A培养反复洗涤、离心3次，弃上清，以无血清McCoy’5A培养液稀释细胞并调整细胞浓度至3×107/ ml；取该细胞悬液0.1ml/只均注射于裸鼠右上肢跟部的背部皮下。

    1.6  分组治疗

    待肉眼可见裸鼠接种部位有肿瘤长出后，将15只裸鼠随机分成三组，每组5只。空白对照组：不用任何药物；二甲亚砜对照组：二甲亚砜0.5μl/(g·d)-1，一日一次灌胃； MK886治疗组：MK886 0.015mg/(g·d)-1溶于二甲亚砜10μl中一日一次灌胃。连续治疗4周。

    1.7  观测肿瘤生长情况及裸鼠一般情况

    分别于治疗后第1、3、7、14、28 d用游标卡尺测量每个肿瘤大小，并重复测量三次，取平均数，以下述公式计算肿瘤体积：V=ab2π/60,a：肿瘤结节的最大直径,b：肿瘤结节的横径，末次测量后脱颈处死裸鼠，切除肿瘤称重。治疗期间还要连续观察裸鼠的饮食、大便、精神、活动与消瘦等情况。

    1.8  制作肿瘤病理切片

    处死裸鼠后解剖并取出完整瘤块，用10%福尔马林固定标本，制作病理切片，部分切片行HE(苏木素－伊红)染色，常规光镜下观察肿瘤组织学形态。

    1.9  TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况

    石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，H2O2封闭30min后加入PBS(pH7.4)振荡3次，每次5min，蛋白酶K消化液作用25～30min（37℃）后再以PBS振洗3次，每次5min，依次加TUNEL反应液、过氧化物酶连接的抗荧光素抗体并于37℃孵育，PBS振洗后DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透化，中性树脂封片。具体操作步骤按试剂盒说明进行。每批染色均设阴性对照（PBS代替一抗），阳性结果判断：阳性染色的细胞核染成棕色，为凋亡细胞。凋亡指数（AI）以高倍镜下计数每1000个细胞中阳性细胞百分比表示。

    1.10  免疫组化法检测肿瘤组织中5LOX表达情况

    石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，置于10mmol/L柠檬酸缓冲液 (pH6.0) 中，用微波处理以修复抗原，冷却至室温，1% H2O2甲醇孵育15min，滴加10%猴血清15min以封闭非特异性抗原，弃去血清，滴加一抗（1∶100稀释的羊抗人5LOX多克隆抗体）后4℃放置过夜，PBS液冲洗3次后滴加生物素标记的二抗，37℃孵育60min，PBS液再次冲洗3次后滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素，37℃孵育60min，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透化，中性树脂封片。以上操作均按试剂公司提供的说明进行。5LOX表达结果判定方法：以胞浆、核膜或胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性细胞，仅细胞核着蓝色者为阴性。

    1.11  统计学方法

    所有数据±s表示,采用SPSS 15.1统计软件进行统计学分析。

    2  结果

    2.1  成瘤率

    本实验用15只裸鼠均于HT29人结肠癌细胞皮下接种后4天在接种部位出现约0.4cm大小的肿瘤结节，成瘤率为100%。所有裸鼠治疗期间均未出现明显的活动减少、反应迟缓、精神萎靡、消瘦等现象。实验结束时无一裸鼠自然死亡。

    2.2  肿瘤生长情况

    2.2.1  治疗结束后测量肿瘤体积值，见表1。表1  裸鼠肿瘤体积(cm3) 以上数据采用方差分析的多重比较（LSD法）结果显示：两对照组瘤体积差异无统计学意义（P=0.729）；MK886治疗组与两对照组之间差异均有统计学意义（P=0.000）。

    2.2.2  各组肿瘤重量比较，见表2。表2  裸鼠肿瘤重量以上数据采用LSD法结果显示：MK886治疗组较两对照组之间差异均有统计学意义（P=0.000），两对照组之间差异无统计学意义（P=0.29）。

    2.3  肿瘤组织病理学检查结果

    HE染色的病理切片在光镜下观察发现，肿瘤细胞弥漫分布，大小、形态不一，胞浆淡染，胞核肥大、呈蓝色深染、可见核分裂象，偶见腺腔样结构，部分视野可见坏死区，符合结肠腺癌的病理学表现，见图1。

    2.4  肿瘤细胞凋亡检测结果

    空白对照组、二甲亚砜对照组、MK886治疗组的AI分别为（3.0438±0.1704）、（3.1800±0.1860）、（10.7100±1.0193）。以上数据采用LSD法结果显示：MK886治疗组较两对照组之间差异均有统计学意义（P=0.000），两对照组之间差异无统计学意义（P=0.29），见图2～4。

    2.5  肿瘤组织中的5LOX表达水平  空白对照组与二甲亚砜对照组肿瘤组织中的5LOX均呈强阳性表达，而MK886治疗组呈弱阳性表达，见图5～7。

    3  讨论

    花生四烯酸的代谢通过环氧合酶和脂氧合酶两条途径完成，而环氧合酶和脂氧合酶是这两条代谢途径的关键酶。在脂氧合酶代谢途径中，5LOX及其产物5HETE 和LTB4、8LOX及其产物8HETE、12LOX及12HETE均可促进肿瘤的发生发展，而近来研究较多的是5LOX及其代谢产物。如实验资料显示，在人前列腺癌、结肠癌等肿瘤患者体内均检测到白三烯的过量表达[1]；WeiGang Tong等对六种不同的人胰腺癌细胞体外实验显示，该六种人胰腺癌细胞均有LTB4受体不同程度的表达，且LTB4受体拮抗剂LY293111能抑制这些胰腺癌细胞的生长与增殖[2]；在人类前列腺癌组织中5HETE 的形成和抑制可分别促进和抑制前列腺癌细胞的生长[3]；动物体内实验也证实，LTB4受体拮抗剂LY293111可抑制裸鼠结肠癌的生长[4]。

    MK886是5LOX活化蛋白（FLAP）抑制剂。5LOX在催化花生四烯酸代谢生成LTB4的过程中尚需5LOX活化蛋白（FLAP）传送底物来协助，MK886能特异性与FLAP结合而抑制5LOX的活性，从而阻止花生四烯酸的5LOX代谢途径。实验证明特异的FLAP 抑制剂MK886能有效抑制人乳腺癌、结肠癌细胞生长与增殖并诱导其凋亡[5,6]，动物体内实验也显示了MK886 的抗胰腺癌作用[7]。本实验通过5LOX抑制剂MK886对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤治疗作用的研究发现，应用MK886治疗的裸鼠肿瘤生长缓慢，治疗结束后所测得的治疗组肿瘤平均体积、重量均明显低于对照组，差异有统计学意义（P=0.023，P=0.025，P=0.00）；用TUNEL法检测肿瘤组织细胞AI，结果显示用MK886治疗组的肿瘤组织细胞明显高于对照组，差异有统计学意义（P=0.00）；用免疫组织化学检测肿瘤组织中5LOX表达水平，结果显示MK886治疗组的5LOX表达水平明显低于对照组；而空白对照组与单用二甲亚砜对照组之间的肿瘤体积、重量、肿瘤组织细胞AI差异均无统计学意义（P＞0.05），且两对照组之间5LOX表达水平亦无统计学意义。

    因此，通过本实验可以证实，5LOX与结肠癌的发生发展密切相关，5LOX活化蛋白抑制剂MK886可有效抑制人结肠癌的生长并降低其5LOX表达水平，其抗癌机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡，亦可能存在其他抗癌机制，有待进一步研究。

【参考文献】[1] Leval X,Julemont F,Delarge J,et al.New trends in dual 5LOX/COX inhibition[J].Curr Med Chem,2002,9(9):941962.

[2] Tong WG,Ding XZ,Hennig R,et al.Leukotriene B4 receptor antagonist LY293111 inhibits proliferation and induces apoptosis in human pancreatic cancer cells［J］.J Clinical Cancer Research,2002,8(10):32323242.

[3] Gupta S,Srivastava M,Ahmad N,et al.Lipoxygenase25 is overexpressed in prostate adenocarcinoma [J] .Cancer,2001,91(4):737743.

[4] Hennig R,Ding XZ,Tong WG,et al.Effect of LY293111 in combination with gemcitabine in colonic cancer[J].Cancer Letters,2004,210(1):4146.

[5] Avis I,Hong SH,Martinez A,et al.Fivelipoxygenase inhibitors can mediate apoptosis in human breast cancer cell lines through complex eicosanoid interactions[J].FASEB Journal,2007,15(11):20072009.

[6] Cianchi F,Cortesini C,Magnelli L，et al.Inhibition of 5lipoxygenase by MK886 augments the antitumor activity of celecoxib in human colon cancer cells[J].Molecular Cancer Therapeutics,2006,5(11):27162726.

[7] Schuller HM,Zhang L,Weddle DL,et al.The cyclooxygenase inhibitor ibuprofen and the FLAP inhibitor MK886 inhibit pancreatic carcinogenesis induced in hamsters by transplacental exposure to ethanol and the tobacco carcinogen NNK[J].Journal of Cancer Research & Clinical Oncology,2002,128(10):525532.