HLAA2限制性人食管癌相关抗原COX2表位的鉴定和改造

　　作者：祁峰，高艳锋，孙战强，胡红敏，陈鲤翔，祁元明    作者单位：郑州大学生物工程系 　　【摘要】  目的 筛选和鉴定食管癌广泛高表达蛋白COX2的HLAA2限制性CTL表位。方法 运用生物信息学的方法，以SYFPEITHI法初步预测，结合MHCPred 2.0和NetChop3.0 Server在线分析，设计出五条新的抗原肽。通过标准Fmoc固相合成法合成抗原肽，以流式细胞仪对其与HLAA2分子的结合力和稳定性进行分析，并对结合力较低的P66（FI<0.5）的原始序列进行改造，将其序列第一位的苯丙氨酸替换成酪氨酸（P66Y1），以MTT实验检测抗原肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用。 结果 P321对HLAA2分子有较高的结合力（FI＝1.93），同时P66Y1与HLAA2分子的结合力显著增强（FI＝1.48），并且它们与HLAA2分子的稳定性较好（DC50>2h）。P321和P66Y1对表达COX2的EC9706、EC1的杀伤率分别明显高于P66。结论 源于食管癌广泛高表达抗原COX2的抗原肽P321和P66Y1能分别有效激发HLAA2限制性CTL的免疫应答并杀伤肿瘤细胞。

　　【关键词】  COX2；抗原肽；HLAA2；表位

 　　Identification and Optimization of  HLAA2 Restricted COX2 Derived Antigen Peptides

　　QI Feng,GAO Yanfeng,SUN Zhanqiang,HU Hongmin,CHEN Lixiang,QI Yuanming

　　Department of Bioengineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China

　　Corresponding Author:QI Yuanming,Email:qym@zzu.edu.cnAbstract：Objective   To identify the HLAA2 restricted CTL epitopes of overexpressed COX2 in esophageal carcinoma （EC）.Methods  Five novel HLAA2 restricted peptides of COX2derived antigen were predicted by SYFPEITHI prediction method combined with MHCPred and NetChop3.0 Server.The candidate peptides were synthesized by standard Fmoc chemistry and their binding affinity and stability to HLAA2 molecule were evaluated by flow cytometry.Otherwise the weak binding peptide P66 （FI<0.5） was optimized by substituting its phenylalanine with tyrosine,and the cytotoxic activities against the EC cells were determined by MTT assay.Results  P321 showed higher affinity （FI=1.93）for HLAA2 molecule compared to other candidate peptides and P66Y1 exhibited remarkable affinity for HLAA2 molecule （FI=1.48）.Furthermore,these two peptides could bind stably with HLAA2 molecule （DC50>2）.The MTT assay reflected that P321 and P66Y1 could specifically lyse EC1 and EC9706 cells which expressed COX2 compared to P66.Conclusion  P321 and P66Y1  derived from overexpressed COX2 in esophageal carcinoma are potential epitopes which are capable of inducing HLAA2restricted CTLs and killing HLAmatched EC cells.

　　Key words：COX2;Antigen peptide;HLAA2;Epitope

　　肿瘤内源性抗原肽和MHCΙ分子结合之后相互作用是诱导特异性T细胞免疫的重要分子基础。肿瘤内源性抗原首先被蛋白酶体加工成寡肽片段（一般为九肽），这些表位肽与MHC分子相结合形成稳定的肽/MHC分子复合物，再由抗原呈递细胞（APC）呈递给T淋巴细胞从而诱导出抗原特异性CTL行使肿瘤免疫的功能。所以抗原肽与MHCΙ分子之间的亲和力是诱导免疫应答反应的关键因素[1]。T2细胞是抗原转运相关蛋白（TAP）分子缺陷的细胞株，这种细胞不能呈递内源性的抗原，却可以俘获并呈递外源性的抗原肽。利用T2细胞株筛选HLAΙ（人的MHCΙ分子）限制性高亲和力的抗原肽已经成为快速而准确的实验方法，为筛选有效的针对特定靶蛋白的抗原肽提供了基础。环氧合酶2（COX2）是最近在食管癌细胞中发现有高表达的蛋白（鳞癌91%、腺癌78%）[2]，近年来有报道COX2的过度表达与多种上皮性肿瘤发生发展关系密切，并且发现许多抑制COX2的药物能够对某些肿瘤具有预防和治疗作用 [2]，但是以COX2为靶点来筛选抗原肽却未见报道。本文以我们先前的生物信息学筛选方法和结果为基础[3]，运用生物信息学方法即MHC配体和多肽模式数据库(SYFPEITHI)初步预测，结合MHC分子结构表位预测算法（MHCPred2.0）和蛋白酶体裂解基序(Netchop3.0 Server)分析，筛选出与HLAA2分子（我国表达HLAA2的人群达到53%[4]）具有高亲和力和较强稳定性COX2来源的抗原肽[5]，并且对与HLAA2分子结合力较低的抗原肽，通过改变影响抗原肽与HLAA2分子结合锚定位点的氨基酸，从而增强它们之间结合力[6]。本文中的抗原肽P321和经过氨基酸序列改造的抗原肽P66Y1均尚未有报道。

　　1  材料与方法

　　1.1  试剂与仪器

　　Fmoc保护氨基酸，苯并三氮唑N,N,N’,N’四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、N羟基苯并三氮唑（HOBt）、三氟乙酸（TFA），Wang树脂，苯甲硫醚（Thioanisole），1,2乙二硫醇，二氯甲烷；N,N二甲基甲酰胺，哌啶（纯度99%，其余试剂均为分析纯）均购于上海吉尔生化有限公司。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，鼠抗人HLAA2单克隆抗体（BB7.2）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠二抗及布雷菲德氏菌素（Brefeldin A）购自美国Sigma公司，β2微球蛋白购自德国Merck公司，T2细胞由第三军医大学吴玉章教授惠赠。SCL10A VP高效液相色谱仪购自日本Shimadzu公司，电喷雾质谱仪（ESIMS）购自美国Mariner公司，Ultrospec3000型分光光度仪购自美国Pharmacia Biotech公司，流式细胞仪购自美国Beckson Dickson公司。

　　1.2  COX2抗原肽HLAA2限制性表位的预测

　　首先运用MHC配体和抗原表位肽数据库（SYFPEITHI）预测，将分值较高的抗原肽再基于结构的表位预测算法（MHCPred2.0）进行结构亲和性分析。把初选出的九肽通过蛋白酶体裂解基序（Netchop3.0 Server）酶切分析。

　　1.3  抗原肽的合成、纯化、分析及鉴定

　　采用标准固相Fmoc方案进行合成，经RPHPLC纯化后，经分析其纯度大于95%。使用电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其分子量。

　　1.4  候选抗原肽与HLAA2分子结合力试验

　　待测肽（50μg/ml）加入含β2微球蛋白（0.1μg/ml）的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18～24h后，冷PBA（等渗磷酸盐缓冲液＋0.1%牛血清白蛋白＋0.01%叠氮钠）洗涤3次，加100μl稀释度为1∶200的一抗鼠抗人单克隆抗体BB7.2，4℃孵育30min。冷PBA洗涤3次后，加50μl稀释度为1∶50的FITC羊抗鼠二抗溶液，4℃孵育30min，洗涤后于流式细胞仪检测，实验重复3次，PBS（等渗磷酸缓冲液）作为阴性对照。结果用荧光系数（FI）表示：荧光系数（FI）=（表位肽平均荧光强度－背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度（当FI≥1.5时，该候选肽与HLAA2分子具有强结合力；当1.0≤FI<1.5时，该侯选肽为中等结合力；当0.5≤FI<1.0时，该侯选肽为低结合力；当FI<0.5时为无结合力）。

　　1.5  候选抗原肽/HLAA2复合物稳定性分析

　　待测肽（50μg/ml）加入含β2微球蛋白（0.1μg/ml）的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18h后，冷PBA洗涤3次，洗净未结合的肽。加入10μg/ml的Brefeldin A孵育1h，洗涤。37℃，5%CO2孵育0、2、4、6h。然后，冷PBA洗涤3次，加一抗鼠抗人单克隆抗体BB7.2，4℃孵育30min，冷PBA洗涤3次后，加FITC羊抗鼠二抗溶液，4℃孵育30min，洗涤后于流式细胞仪检测，实验重复3次。结果以DC50（即肽/HLAΙ复合物的半衰期）表示。若DC50>2，则该候选肽与HLAΙ分子形成的复合物稳定性良好。

　　1.6  MTT实验测定杀伤率

　　诱导成熟的CTL作为效应细胞，EC1和EC9706食管癌细胞作为靶细胞，按效靶比20∶1加入96孔板中，靶细胞每孔4×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200μl，置37℃5％CO2，饱和湿度条件下培养4h，MTT法检测各孔A570nm值。按以下公式计算杀伤率。

　　杀伤率=[1-（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100%

　　1.7  统计学方法

　　采用SPSS11.5统计软件进行数据处理，每组实验重复3次，用t检验分析最终结果，以±s表示。

　　2  结果

　　2.1  COX2来源的抗原肽HLAA2限制性表位的预测

　　运用生物信息学的方法，SYFPEITHI初步预测，结合MHCPred2.0和NetChop3.0分析，设计出五个不同分值的九肽作为肿瘤相关抗原COX2新的候选抗原肽，经BLAST分析后确定仅与目的蛋白有同源性。

　　尽管抗原肽P66在SYFPEITHI预测的分值较高，但是在随后的结合力实验中发现其与HLAA2之间的结合力很弱。由于抗原肽的第二位和第九位氨基酸是与MHC分子的锚定位点，往往改变锚定位点相邻的氨基酸（例如把第一位点的氨基酸替换成酪氨酸）可以增强其与MHC分子的结合力并且特异性不受影响[4]。我们将P66的第一位氨基酸由苯丙氨酸替换为酪氨酸，替换之后的P66类似物P66Y1的SYFPEITHI、MHCPred2.0和NetChop3.0预测的分值均有所改善，见表1。表1  COX2来源的候选抗原肽的筛选

　　2.2  标准Fmoc固相合成法合成候选肽

　　经过标准Fmoc固相合成法合成的六条候选肽经过质谱分析，分子量与理论值相符合。

　　2.3  候选抗原肽与HLAA2分子结合力实验结果

　　在所有经过生物信息学方法初步筛选出来的候选肽中，P321表现出了与HLAA2分子较高的亲和力。经过氨基酸改造后的P66Y1与P66相比，与HLAA2分子的结合力有显著性提高。P66Y1和P321两者的荧光系数（FI）分别为1.48和1.93，即P66Y1与HLAA2分子具有中等结合力，而P321与HLAA2分子具有强结合力，见图1。

　　2.4  抗原肽/HLAA2复合物稳定性分析结果

　　将与HLAA2分子具有中等结合力的P66Y1和强结合力的P321进行候选肽/HLAA2复合物稳定性实验。结果显示，P321和P66Y1的平均荧光强度（MFI）随时间的延长（0、2、4、6h不同的时间点）依次减弱，见图2。两个候选肽的DC50（即肽/HLAΙ复合物的半衰期）均＞2。

　　2.5  细胞毒试验结果

　　MTT的结果显示对于表达COX2的食管癌细胞株EC1和EC9706， P321和P66与阴性对照（No peptide）相比有明显的杀伤活性（P<0.05）。

　　3  讨论

　　在体内MHCⅠ分子和被呈递的抗原肽之间的结合是肿瘤免疫反应的首要步骤，对肿瘤抗原的高亲和力被证明是在体内产生抗肿瘤免疫反应的重要因素[7]。1991年比利时科学家Boon等[8]采用功能基因组研究策略首次成功分离人黑色素瘤抗原MAGE家族，随后一系列的肿瘤特异性抗原被分离鉴定如BAGE（癌睾丸抗原家族）、hTERT（端粒酶抗原家族）、CEA（癌胚抗原）等。目前已被鉴定的肿瘤抗原可分为肿瘤睾丸抗原、肿瘤分化抗原、病毒相关抗原、突变抗原及过表达抗原[9]。Minev等针对癌睾丸抗原家族蛋白和端粒酶抗原家族蛋白的肿瘤免疫治疗已经取得了初步进展[10，11]，但是由于受到免疫逃避及自身免疫反应等问题在向肿瘤疫苗转化的过程中遇到困难。COX2属于肿瘤过表达抗原家族，它的高度组织特异性表达与肿瘤的发生和侵袭有着密切关系[12]。因此以过表达抗原为肿瘤免疫的靶位点进行CTL表位筛选，将有助于推进新型肿瘤疫苗的探索和多价肿瘤疫苗的优化策略。

　　我们运用SYFPEITHI初步预测，结合MHCPred2.0和NetChop3.0 Server分析，缩小了所需验证抗原肽的范围，根据结果初步筛选出了分值较高的五个COX2来源的HLAA2限制性肿瘤相关抗原肽。通过体外T2细胞与抗原肽结合实验和结合稳定性实验，这些初筛出的肽在体外与HLAA2分子的结合显示出较大差别，大部分初筛出的肽与HLAA2分子的结合力很弱，只有P321表现出与HLAA2分子具有较强结合力（FI=1.93）。但是如果改变影响抗原肽和MHCⅠ分子结合锚定位点部位的氨基酸序列，则可以大大增强两者的结合力。将初筛出的与HLAA2分子结合力很弱的P66（FI<0.5）的第一位氨基酸换成酪氨酸（P66Y1），则P66Y1与HLAA2分子的结合力显著增强（FI=1.48）。稳定性实验显示P66Y1/HLAA2和P321/HLAA2复合物的稳定性较好（DC50>2）。这两个可与HLAA2分子形成稳定复合物的抗原肽为构建以肿瘤抗原COX2为基础的肿瘤疫苗提供了新的表位。

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