低剂量辐射超敏感性分子机制的研究进展

作者：陶丹    作者单位：430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心     【关键词】  低剂量辐射 低剂量辐射超敏感 分子机制

    低剂量辐射超敏感性(hyperradiosensitivity，HRS)是细胞对很低剂量照射(约0.02～0.50Gy)较敏感而对其后剂量区域(0.50～1.00Gy)敏感性下降的现象[1]。该现象首先于1963年从玉米低于0.5Gy剂量的照射研究中被证实,它表现为玉米接受低剂量(≤0.5Gy)γ射线照射时,存在超敏感性，诱导的花粉突变及致死性均比剂量高时敏感。随后，在许多离体和在体实验中均证实了该现象的存在，目前就已知有超过40种细胞系存在着HRS [2]。对HRS进行研究有着深刻的现实意义，但对其发生的机理目前尚不十分明确。

    迄今为止，对HRS机制的研究，主要是从细胞凋亡、细胞周期调控以及DNA断裂双链(DNA DSBs)的修复这三个方面来进行；一些基因、蛋白，如p53，bcl2，cmyc，共济失调毛细血管扩张突变(ataxiatelangiectasia mutated，ATM)激酶和DNA依赖的蛋白激酶(DNAdependent protein kinase，DNAPK)等被认为可能与HRS的发生有关。本文主要从以上三个方面来阐述其可能的发生机制。

    1  细胞凋亡与HRS

    目前有许多研究表明，细胞在低剂量辐射下，凋亡是其死亡的主要形式[37]；一些基因或蛋白，如p53，bcl2，cmyc，p21ras(ras癌基因家族编码的蛋白产物)等，表达水平出现了显著的变化[3,69]。在这些基因中，研究最多的是p53和bcl2基因。

    Mothersill等[3]于1995 年观察离体人尿路上皮细胞在不同剂量照射下，细胞的存活增殖情况，发现放射剂量<1 Gy时，出现HRS，细胞发生凋亡；并且，p53，bcl2，cmyc，p21ras和表皮生长因子受体 (EGFR)的表达显著升高。随后，Enns等[4]研究了人肺腺癌A549、神经胶质瘤T98G和乳腺癌MCF7等细胞株在γ射线(0～2Gy)照射下的不同反应特点，发现A549和T98G细胞株存在HRS，MCF7细胞株不存在HRS。接着，他们通过检测三种细胞株中活化的caspase3和Annexin V来观察细胞在0～1Gy剂量区域辐射下凋亡的情况，发现A549和T98G细胞均发生显著的凋亡，凋亡峰值分别出现在0.1Gy和0.2Gy处，而MCF7细胞没有发生显著的凋亡(P<0.005)。此外，用p53的抑制剂pifithrin对A549和T98G细胞株进行干预后，细胞的HRS均消失。观察与此相似的模型，对p53缺失的细胞株（皮肤成纤维细胞系2800T和结直肠癌细胞系HCT116），进行同样条件的照射，HRS和凋亡都没被发现。由此得出，p53是调控细胞凋亡和HRS的一个关键因子。

    在低剂量辐射下，p53不仅作为抑癌基因对肿瘤细胞的生长增殖进行调控，而且可以通过增强肿瘤细胞的低剂量放射超敏感性来加强对肿瘤细胞的杀伤。但是，也有报道提出了HRS与p53无关的观点[5,6]。Krueger等[5]研究了T98G、U373、MR4和3.7细胞的HRS现象，发现HRS与细胞的凋亡有关；其中T98G和U373细胞表达突变型p53、MR4和3.7细胞表达野生型p53、T98G 和MR4细胞表现出HRS，而U373和3.7细胞未出现HRS，由此得出HRS与p53无关的结论。提示在HRS现象中，可能存在着与p53无关的其他凋亡途径。

    bcl2基因是低剂量辐射中研究较多的另一个基因。许多研究发现，在低剂量辐射下，bcl2基因和蛋白的表达是下降的。Dey等[6]对头颈鳞癌细胞株SCC61和SQ20B(两者均存在HRS)给予0.5Gy/次，总剂量为2Gy的照射，并用蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)对bcl2蛋白进行检测，发现其表达均较辐射前下降。Kroger等[7]对淋巴瘤的研究也得出了bcl2基因和蛋白表达下降的结果。但对于低剂量照射下bcl2的表达水平也有不同的报道。Sur等[8]在对食管癌近距离的放射治疗中，观察到治疗前后bcl2的表达水平没有变化。Szostak等[9]对前列腺癌近距离放射治疗患者的bcl2进行检测，发现在治疗后不论成功组还是失败组，bcl2比治疗前均升高，但失败组比成功组更高(30.5%与13.1%，P<0.05)。

    从上我们可得出，在低剂量辐射下，凋亡是肿瘤细胞死亡的主要机制。HRS的发生与许多凋亡相关基因，如p53，bcl2等基因有关，但对于HRS与p53和bcl2基因表达水平的关系的研究意见尚存在争议，还需要进一步的研究。

    2  细胞周期调控与HRS

    众所周知，DNA损伤的修复与细胞周期调控是影响细胞放射敏感性的两个重要因素。已知电离辐射照射哺乳动物将导致细胞G1、S和G2期的延缓，这些延缓是由细胞周期中一系列的检查点所介导的。其中S期的检查点主要是阻止受损DNA的复制，G1/S和G2/M期的检查点则是让受损DNA在进入S或M期之前有充足的时间进行修复。整个过程包括对受损DNA的感应识别，以及由此启动的一系列的信号传导和最后的效应阶段(细胞死亡、DNA断裂链的修复、基因突变) [10]。其中对损伤的识别有着重要的地位，它直接影响着其后的一系列过程，对细胞的死亡、修复和基因突变有着决定性的作用。目前认为，ATM是识别DNA断裂双链最重要的因子，它的活化将引起细胞周期的检测阻滞与DNA的修复。

    2.1  ATM概述

    ATM是共济失调毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia,AT)的致病基因，AT是一种常染色体隐性遗传病，其临床特征有小脑退化、免疫缺陷、染色体不稳定性、细胞周期紊乱，对放射线及类射线细胞毒药物极度敏感等。由于AT患者这种特殊的遗传性的辐射敏感性，使得ATM成为放射生物学界研究辐射敏感性机制的重要对象之一。

    ATM基因位于人类染色体11q2223，其编码蛋白ATM是含有3 056个氨基酸的相对分子质量为350 KD的大分子核蛋白，属于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族成员。

    目前认为，ATM在细胞信号传导通路中起着重要的作用，它主要参与细胞周期的调控和对DNA损伤的识别与修复。该通路为：DNA损伤激活ATM激酶，主要是第1981位丝氨酸的磷酸化(ATM1981SerP)，随后磷酸化其下游的相应蛋白，使细胞在细胞周期关卡处停滞分裂，主要是G1/S 期和G2/M 期的阻滞，使损伤得以修复，修复失败则细胞进入凋亡进程。

    2.2  ATM介导的细胞周期阻滞信号传导通路

    G1/S期阻滞的信号传导通路如下：损伤感受器ATM感受识别DNA断裂链后，其1981位丝氨酸自我磷酸化而活化，随后引起p53蛋白表达水平的升高及磷酸化，p53的磷酸化促进了细胞周期依赖性磷酸转移酶抑制剂(CDKI)p21 的表达，后者抑制了与细胞周期蛋白CyclinE、CyclinA相结合的CDK的活性，并由此阻止细胞由G1期进入S期[11]。

    G2/M期阻滞的信号传导通路如下：损伤感受器ATM感受识别DNA断裂链后活化，随后，ATM通过激活细胞周期检测点激酶2(CHK2)，使CDC25磷酸化而失活，后者失活后不能将细胞周期蛋白依赖性激酶cdc2(即CDK1，在细胞周期调控中起着调控G2至M期的作用)上的Thr14/Tyrl5磷酸基团去磷酸化，使得cdc2无法激活，细胞阻滞在G2/M交界处[12]。

    2.3  ATM与HRS

    HRS可简单的理解为：细胞在低剂量辐射下，修复减少，死亡增加；在其后剂量区域辐射下，修复增多，死亡减少。如此不同的效应，使研究者把目光的焦点投向损伤的识别和信号传导阶段。而ATM是识别DNA断裂双链最重要的因子。

    目前，尚无直接关于ATM与HRS关系的研究。但对细胞在低剂量辐射下ATM1981SerP水平的变化有以下研究：Collis等[13]对4种不同的肿瘤细胞系进行了相同剂量、不同剂量率辐射的研究，发现与高剂量率(HDR)相比，低剂量率(LDR)辐射下细胞的杀伤效应较强，ATM1981SerP水平较低；而在LDR前用氯喹预先活化ATM激酶或在HDR前用siRNA技术抑制ATM蛋白的表达，则LDR和HDR对细胞的杀伤效应相当。研究还发现，LDR辐射后细胞的存活分数低于剂量效应曲线的预测值，提示只有当DNA断裂双链数量达到一定阈值时，才能有效启动细胞的监测机制。Bakkenist等[14]在ATM激活机制的研究中，对人成纤维细胞进行不同剂量(0～9 Gy)的辐射后，用免疫印迹法检测ATM1981SerP水平，发现ATM1981SerP在0.1Gy时开始出现，到0.4Gy时达到高峰，而1～9Gy区间水平无进一步升高。提示ATM激酶的活化有一阈辐射剂量，而这个活化的阈剂量与HRS的剂量区域相似。从而推测ATM可能是HRS发生体系中的一员[15]。

    ATM在HRS中的作用可能是：低剂量辐射下，未能激活DNA损伤的感受器ATM，DNA损伤信号无法传导，ATM介导的细胞修复通路不能被激活，从而导致细胞的杀伤作用增强，表现出 HRS；随着辐射剂量的增加，DNA损伤的感受器ATM被激活，DNA损伤信号进行传导，细胞被阻滞、修复，细胞的杀伤反而下降，表现出辐射抗性。

    2.4  细胞周期与HRS

    研究显示，与G1期和S期相比，G2期细胞的HRS更显著。Marple等[10]对中国仓鼠V79细胞株进行0.1～10Gy剂量的60Coγ射线照射后，发现当剂量<1Gy时，细胞出现HRS，HRS主要发生在G2期细胞，G1期和S期细胞没有出现。与仓鼠V79细胞系一样，人胶质瘤T98G细胞系也存在HRS，运用流式细胞术检测T98G细胞在低剂量辐射下(<0.3Gy)细胞内组蛋白H3磷酸化水平(组蛋白H3的磷酸化通常代表细胞进入M期)，发现受损的细胞未发生G2/M期阻滞，而直接进入M期。因此得出HRS可能是受损的G2期细胞在未经修复的情况下直接进入M期所引起。

    2.5  细胞周期检查点与HRS

    在信号传导通路中，检查点担当着信号传感器的角色。G1/S期阻滞高度依赖于p53蛋白，目前已发现有超过50 %的恶性肿瘤细胞p53基因发生突变，即表达突变型p53基因，它们只有通过不依赖于p53的G2/M检查点，来检测受损DNA。G2/M的检查点包括常规检查点和特异检查点两种，前者是不依赖ATM激酶，而依赖辐射剂量的检查点，它的作用是将G1或S期接受辐射的细胞阻止在G2期；与之相反，后者依赖ATM激酶，与ATM活化类似，只有当辐射剂量达0.4 Gy时才被激活，而在1～10Gy区间不依赖辐射剂量，活性不变，它的作用是阻止G2期受损细胞在未经修复的情况下进入M期[16]。使研究者感兴趣的是，特异检查点活化的辐射剂量阈值与产生辐射抗拒的剂量阈值相似。因此，推测HRS的发生机制中可能也包含G2/M特异检查点[17]。

    3  DNA DSBs的修复与HRS

    目前，已有大量研究资料表明，DNA是辐射致死效应中细胞内最重要的靶，而在DNA的各种损伤中，DNA双链断裂又是与细胞死亡关系最密切的一种。因此，在细胞辐射敏感性的研究中人们首先考虑到，是不是细胞中DNA DSBs的生成量及其修复能力决定了细胞的辐射敏感性。比较一致的看法是电离辐射引起的DNA双链断裂，若能通过某种修复机制使其相互连接起来，细胞就存活，表现为放射抗拒；而缺乏修复或错误修复辐射导致的DNA DSBs则成为细胞死亡的关键因素。

    DNA DSBs可通过多种途径修复，真核细胞中主要有两条途径，即非同源末端连接修复(NHEJ)和同源重组修复(HR) [18]。NHEJ由DNA依赖的蛋白激酶( DNAPK)介导完成或者由MRE11RAD50NBS1蛋白复合物的协调作用来完成。HR则在rad52基因群及同系物所组成的复合物的作用下完成，它要求姐妹染色体链间的序列同源性，而且主要和DNA复制一起或在SG2期发挥作用。已知在哺乳动物中主要为NHEJ途径，其中DNAPK(由Ku70，Ku80和DNAPKcs三个亚基组成，分别由XRCC5，XRCC6和XRCC7基因编码，分子质量分别为70ku，86ku和350ku)在DNA DSBs的修复中起重要作用。XRV15B细胞系因缺乏DNAPK复合物中的Ku80亚单位，而不表现出放射抗性反应。突变细胞系xrs5也缺乏Ku80亚单位，对辐射表现出极度敏感，但此细胞通过转染人的Ku80基因后其辐射敏感性降低。人恶性神经胶质瘤细胞M059J不表达DNAPKcs蛋白，缺乏DNA DSBs修复能力，因此对辐射很敏感；而人恶性神经胶质瘤细胞M059K，可表达正常的DNAPK，能对DNA DSBs进行修复，因此其辐射敏感性远远不及前者。有作者检测<0.5Gy的低剂量放射后DNAPK的活性，发现在6个有HRS的肿瘤细胞系中DNAPK的活性明显下降，而在4 个没有HRS的细胞系中DNAPK的表达并未减少[19]。提示HRS与细胞中DNAPK的表达息息相关。

    4  结语与展望

    近来，HRS引起了越来越多人的关注，它是对传统的放射生物学的一个有益的补充和发展，对临床放射治疗有着重要的指导意义。有些对辐射常规分割剂量2Gy表现出抵抗的细胞，在低剂量辐射时却表现出极度敏感，因而就有可能利用低剂量超敏现象来设计新的分割方式，从而提高治疗增益比，但前提条件是放射抗拒的肿瘤比正常组织的超敏性更强。若能找出决定低剂量超敏反应的分子，我们就能通过检测细胞中是否存在这些分子而挑选出对低剂量辐射敏感的个体及细胞。目前对HRS的研究还只是处于一个开端，大量的研究结果来源于对离体细胞及动物的研究，对人体HRS的研究还比较少，在许多方面，如人体各个正常组织是否存在HRS及其特点，肿瘤与正常组织对低剂量辐射的敏感性差异，以及低剂量辐射与致癌相关性等方面，还有待于更进一步的研究。

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