拟Smac促凋亡多肽的合成及其生物活性的初步研究

作者：王竞    作者单位：430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科     【摘要】  目的 探讨拟Smac多肽的合成及其对膀胱癌细胞的促凋亡生物活性。方法 应用固相多肽合成技术，合成具有细胞膜穿透性SmacN7融合多肽，经RPHPLC纯化、纯度分析，用质谱仪定性鉴定；通过荧光显微镜观察细胞凋亡形态、细胞增殖抑制率测定及流式细胞仪分析，研究其对低剂量丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡促进作用。结果 可穿透性融合多肽SmacN7产物峰纯度达95％以上，分子量为3278.08，质谱鉴定结果与合成预期结果完全一致；50～500μg/L SmacN7 作用12～48h，肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变；随着SmacN7浓度的增加或作用时间的延长, 细胞增殖抑制率出现明显增加,药物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分别为（9.62±1.07）%～（61.48±1.15）%、（24.17±1.02）%～（72.86±1.68）%、（43.24±1.15）%～（84.91±1.74）%；肿瘤细胞凋亡率也明显增加，分别为（6.12±1.16）%～（49.81±2.11）%、（13.47±1.15）%～（64.54±2.27）%、（28.91±1.08）%～（82.36±2.19）%。结论 固相合成的拟Smac融合多肽SmacN7为高纯度的目的肽，能够稳定地转入细胞内且利用率高，并有明显促进低剂量丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞凋亡的生物活性，为进一步研究膀胱肿瘤的生物治疗积累了有价值的资料。

    【关键词】  Smac 固相合成 肽 生物活性

    线粒体促凋亡蛋白Smac（the second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI  Smac/DIABLO）作为一种IAPS调节蛋白，在凋亡信号的刺激下能促进凋亡的发生，其N端的AVPI四肽序列是结合IAPS并发挥凋亡作用的重要结构域，其中的Ala1残基插入BIR3表面凹槽的一个疏水口袋内，以氢键与BIR3结合［1］，但Smac必须在胞浆中才能行使其功能［2］。天然的Smac的AVPI序列短肽不能有效地通过细胞膜，而且有体内不稳定、易降解、利用率低及与XIAP亲和力不够等缺点。果蝇触角转录因子是一个很重要的膜调控蛋白，其分子中的短序列RQIKIWFQNRRMKWKK所构成的蛋白转导结构域具有良好的跨膜转运方式，可以引导多肽和蛋白质进入目标细胞［3］。本研究以Smac蛋白的AVPI为靶点，Fmoc化学法（固相合成法）合成AVPIAQK七肽并与具有细胞膜穿透性的果蝇触角因子蛋白转导结构域以脯氨酸（P）相连合成拟Smac促凋亡多肽SmacN7。探讨融合多肽SmacN7的细胞膜穿透性及其促进低剂量丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞凋亡的生物活性，为临床膀胱肿瘤的治疗提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    各种合成肽单体（西安联美生物科技有限公司），三氟醋酸和乙氰（Tedia公司），RPMI1640培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），MTT和DMSO（Sigma公司），MMC（日本协和发酵株式会社），Annexin VFITC凋亡试剂盒(晶美公司)；Hoechst33258染色试剂盒（武汉凌飞公司）；HPLC (WatersTM600E，USA)，质谱仪（LCQTM, Finnigen, USA），流式细胞仪（FACScalibur, BD,USA），酶标仪(BioTec, USA),荧光显微镜（Nikon, Japan）。

    1.2  细胞培养

    人膀胱癌T24细胞株购于武汉大学物种典藏中心。用含10％胎牛血清、双抗（青霉素、链霉素各100U／ml）的RPMI1640培养基常规培养。

    1.3  融合多肽SmacN7的设计、合成及纯化

    以Smac N端AVPI四肽结构为基础，选择与天然成熟Smac AVPI结合XIAPBIR3的KD值相似的七肽AVPIAQK为合成序列［4］；具有细胞膜穿透性的果蝇触角因子序列RQIKIWFQNRRMKWKK［3］为载体肽，中间以脯氨酸（P）相连。利用人工标准固相合成方案，在固相多肽合成仪上进行。将单个氨基酸顺序加在AVPI的C端并在末端进行生物素标记。固相支持剂为树脂，流动相为1‰TFA（三氟乙酸）水溶液／1‰TFA CH3CN水溶液。经过多步反应合成目标多肽。合成肽使用Waters 600E HPLC仪C18柱（C18 Column，20×50mm）进行纯化，纯度＞95％，旋转蒸发仪真空抽干，低温冷冻干燥后收集结晶物，电子天平称量，1mg/瓶分装，-20℃保存备用。

    1.4  荧光显微镜观察细胞凋亡形态

    采用Hoechst33258染色。T24细胞以0.5×105个／ml接种于6孔板，约60％～80％汇片后，实验组用不同浓度(50、100、200、500μg/L)的SmacN7 1640培养基孵育4h后加入终浓度为0.05mg/ml的MMC继续孵育12h、24h、48h。设不加SmacN7的阴性对照组。4％多聚甲醛固定，PBS洗涤，每孔加入1ml（10μg/ml）Hoechst33258染色液，37℃培养15min后荧光显微镜检测。

    1.5  细胞增殖抑制率测定

    采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法。将T24细胞接种于96孔板，每孔2×104个，按实验分组加入不同浓度（50、100、200、500μg/L）的SmacN7，培养4h后，加入终浓度为0.05mg/ml的MMC，每组设3个复孔，设不加SmacN7的为阴性对照组。继续培养12h、24h、48h后用酶联免疫检测仪测定各孔A490值，计算细胞增殖抑制率IR。IR(%)=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。绘制生长抑制曲线。

    1.6  细胞凋亡检测

    采用Annexin V/PI双染法。对数生长期细胞接种于6孔培养板，每组1×106个细胞，培养24h，加入梯度浓度(50、100、200、500μg/L）的SmacN7，培养4h后每孔加入终浓度为0.05mg/ml的MMC，设不加SmacN7的阴性对照组，继续孵育12、24、48h后待测细胞消化洗涤，调整细胞浓度为5×105个／ml，离心重悬，加入10μl Annexin VFITC和5μl PI，避光室温反应15min后加入结合缓冲液，在FACScalibur流式细胞仪上检测，Cell Quest软件分析。

    1.7  统计学方法

    应用SPSS12.0统计软件处理。结果用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  RPHPLC纯化及质谱鉴定

    SmacN7是一个AVPIAQK七肽与果蝇触角因子蛋白转导结构域RQIKIWFQNRRMKWKK合成的可穿透性融合多肽，分子量为3278.08。经过固相多肽合成再经RPHPLC纯化，收集产物峰，其纯度达95％以上,见图1；质谱鉴定结果表明，SmacN7的分子离子峰与合成预期结果完全一致，见图2。

    2.2  荧光显微镜观察

    T24细胞经Hoechst染色：正常细胞呈长梭形或不规则形；凋亡细胞形态多样，细胞核固缩，异染色质边集成新月状，分界清楚，核膜迂回曲折，细胞质出芽、出泡，凋亡小体形成，荧光信号强。实验组凋亡细胞数明显多于对照组，且不同浓度和时间组凋亡细胞数也有显著差别，见图3。

    2.3  MTT 比色试验

    细胞增殖抑制率见图4。可以看到，SmacN7对T24细胞的抑制作用具有时间和浓度依赖性。随着SmacN7浓度（50、100、200、500μg/L）和作用时间（12、24、48h）的增加，细胞增殖抑制率出现明显增加。同一浓度不同时间点细胞增殖抑制率比较差异有统计学意义（P<0.05）；同一时间点不同浓度细胞增殖抑制率比较差异也具有统计学意义（P<0.05）。

    图4  T24细胞生长抑制曲线图

    Fig 4  The proliferation inhibitory curve of T24 cells

    2.4  Annexin V/PI双染法流式细胞仪分析

    T24细胞经50～500μg/L浓度的SmacN7处理12h、24h、48h后实验组随着SmacN7浓度和作用时间的增加，细胞凋亡率明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），各实验组间结果经方差分析差异有统计学意义（P<0.05），见表1。表1  不同时间不同浓度SmacN7对T24细胞凋亡率

    3  讨论

    IAPS在肿瘤细胞中过表达是肿瘤细胞逃避免疫监视的主要原因，而XIAP是IAPS的主要成员之一。Smac蛋白是细胞内源性的XIAP抑制剂，能在凋亡信号的刺激下，随着细胞色素C从线粒体释放到细胞质，通过取代Caspase9与XIAPBIR3表面凹槽的结合，逆转XIAP对Caspase9的抑制作用，从而释放Caspase9，进而激活Caspase3，放大凋亡的Caspase级联反应活性［5］，因此，如何有效地增加胞浆内Smac蛋白的含量从而达到治疗肿瘤的目的一直是目前研究的热点。研究表明，起始于SmacN端的AVPI的七肽序列能有效地消除XIAP介导的Caspase9的抑制作用［6］，其N端的第一个氨基酸的突变可以使Smac功能完全丧失，而羧基端的突变对其功能无影响［7］。因此，我们以SmacN端AVPI为基础，采用固相多肽合成技术合成AVPIAQK七肽。由于Smac只能在细胞质内发挥作用，而外源性多肽或蛋白这种大分子物质很难穿过细胞膜，所以我们将合成的七肽与果蝇触角转录因子穿透序列融合表达，在其C端逐个加上RQIKIWFQNRRMKWKK，同时在C端进行生物素标记而在N端（Ala位）未进行标记，目的就是为了竞争到更多的结合位点，这样合成的拟Smac新型促凋亡融合多肽SmacN7不影响Smac功能并且具有细胞膜可穿透性。Mizukawa等［8］以果蝇触角穿透序列为载体的Smac合成肽能增加依托泊甙诱导的人恶性胶质瘤细胞的凋亡。Yang等［9］以SmacN端AVPI序列短肽为靶点合成SmacN7R8融合多肽并转染小鼠非小细胞肺癌H460细胞，结果表明SmacN7R8可逆转H460细胞的凋亡抑制作用，当与化疗药物共同作用时在体内可抑制小鼠肿瘤生长而无毒性。另外的研究也表明将Smac的N端部分氨基酸与载体肽融合形成融合肽可以跨过细胞膜增加药物治疗的效果，从而增加多种抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的能力和长期的抗增殖效应［10］。

    本实验以梯度浓度50～500μg/L的融合多肽SmacN7作用于低剂量MMC诱导的膀胱癌T24细胞，能使之出现明显有比较意义的凋亡形态学改变，说明我们合成的拟Smac新型促凋亡融合多肽SmacN7可以稳定地转入膀胱癌T24细胞并在细胞内浓集，利用率高；50μg/L SmacN7作用12小时后肿瘤生长抑制率为（9.62±1.07）%而500μg/L SmacN7作用48小时后肿瘤生长抑制率达到（84.91±1.74）%，说明较低剂量的SmacN7即可显示出对T24细胞增殖的抑制活性；另外，流式细胞仪检测凋亡率与SmacN7处理时间、浓度呈正相关，提示SmacN7能在一定的浓度范围内以时间－剂量依赖方式抑制T24细胞增殖并促进低剂量MMC诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡，显示出良好的促凋亡生物活性，为膀胱肿瘤的生物治疗提供了实验依据。

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