hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用

作者：曹伟军    作者单位：410008 长沙，中南大学湘雅医院消化内科     【摘要】  目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体，研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用。方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段，克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3Basic，检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性。构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERTCD:UPRT，将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA3.1CD:UPRT用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞，筛选稳定表达细胞系，用RTPCR和Western blot方法检测CD基因的表达，用MTT法检测5FC对转染细胞的杀伤作用。结果 成功克隆hTERT核心启动子；荧光素酶活性检测显示，hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%，而在HLF细胞中仅有背景活性。成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体，转染pcDNA3.1CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转染hTERTCD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达，且对5FC敏感；而转染hTERTCD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达，对5FC不敏感。结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞。

    【关键词】  人端粒酶逆转录酶启动子 胞嘧啶脱氨酶 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 胃癌 靶向基因治疗

    自杀基因疗法日益受到人们的关注[1]。CD:UPRT/5FC(胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶/5氟胞嘧啶，cytosine deaminsae: uracil phosphoribosyltransferase/5flurocytosine)是一种高效的自杀基因系统，它将传统的自杀基因CD与UPRT基因联合，构成融合自杀基因，显著提高了抑瘤效果。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是细胞端粒酶活性主要决定因素，在绝大部分肿瘤细胞中重新激活，而在大部分正常体细胞中表达阴性[2]，故hTERT启动子可为基因治疗提供靶向性。本研究构建了hTERT启动子调控的CD:UPRT/5FC自杀基因表达载体，研究其对人胃癌细胞SGC7901的靶向杀伤作用。

    1   材料与方法

    1.1   材料

    1.1.1   细胞和质粒   人胃癌细胞SGC7901和人宫颈癌细胞HeLa为中南大学湘雅医学院肿瘤研究所保存；正常人成纤维细胞HLF购自中南大学湘雅医学院中心实验室。荧光素酶报告基因质粒pGL3Basic、pGL3Control为美国Promega公司产品；质粒pcDNA3.1CD:UPRT由本室构建。

    1.1.2   主要试剂   LA Taq酶试剂盒、AMV逆转录试剂盒、限制性内切酶均为大连宝生物公司产品，pGEMT Easy载体、萤光素酶检测试剂盒、βgal检测试剂盒均为美国Promega公司产品，Lipofectamine2000脂质体为美国Invitrogen公司产品，引物为上海英骏生物技术有限公司合成。

    1.2   方法

    1.2.1   hTERT启动子的PCR扩增及鉴定   以P1: 5′GCGACGCGTGATTCGCGGGCACAGACG3′，P2: 5′AAACTCGAGCCACGTGCGCAGCAGGAC3′为上下游引物（分别引入Mlu Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点），以HeLa细胞的基因组DNA为模板，用Takara LA Taq酶扩增hTERT启动子，克隆入pGEMT Easy载体，构建成pGEMhTERT质粒，大连宝生物公司测序鉴定。

    1.2.2   hTERTpGL3Basic重组质粒的构建及鉴定   将构建的pGEMhTERT用MluⅠ和XhoⅠ作双酶切，回收约255bp的hTERT启动子片段，克隆入pGL3Basic，构建成hTERTpGL3Basic质粒，用PCR和双酶切法鉴定。

    1.2.3   hTERT启动子转录活性的检测   将SGC7901、HLF细胞按每孔1×105个细胞接种至24孔板，当细胞达到85%融合度时进行转染。每种细胞分别转染3种质粒，即hTERTpGL3Basic、pGL3basic、pGL3control，并加βgal作为内对照，48h后检测荧光素酶活性与βgal活性，以两者之比作为荧光素酶相对活性。

    1.2.4   hTERTCD:UPRT表达载体的构建及鉴定   pGEMhTERT用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ作双酶切，回收约255bp的hTERT启动子片段，将其克隆入同样用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ作双酶切的pcDNA3.1CD:UPRT（切除CMV启动子），得到质粒hTERTCD:UPRT，用PCR和双酶切两种方法鉴定。

    1.2.5   质粒转染及阳性克隆的筛选   用Lipofectamine2000脂质体将pcDNA3.1CD:UPRT和hTERTCD:UPRT分别转染SGC7901、HLF细胞，G418筛选出稳定转染的细胞系，分别命名为SGC7901/pcDNA3.1CD:UPRT、SGC7901/hTERTCD:UPRT、HLF/pcDNA3.1CD:UPRT、HLF/hTERTCD:UPRT。

    1.2.6   RTPCR检测CD基因的表达   提取细胞总RNA，按AMV逆转录试剂操作步骤进行逆转录，PCR扩增CD基因，所用上下游引物分别为P1: 5′ATGGTGACAGGGGGAATG3′，P2: 5′TTGTGACCACGACCGAGA3′。

    1.2.7   Western blot检测CD基因的表达   提取细胞总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭2h，1∶500稀释的鼠抗CD多克隆抗体(QED公司)4℃孵育过夜，1∶1 000稀释的兔抗鼠二抗(Sigma公司)室温孵育1h，显色、分析结果。

    1.2.8   MTT法检测细胞存活率   将各组细胞以5×103个细胞/孔接种于96孔培养板中，孵育过夜，加入5FC，使其终浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml，混匀后孵育4d，以MTT法检测细胞存活率。

    1.3   统计学方法   采用SPSS12.0统计软件进行t检验和方差分析。

    2   结果

    2.1   hTERT启动子的PCR扩增及鉴定   PCR扩增得到约267bp的DNA片段，见图1，与预期结果一致；pGEMhTERT载体测序结果显示，克隆的hTERT序列与GenBank (序列号：AB016767)中hTERT序列完全一致。

    2.2   hTERTpGL3Basic重组质粒的构建及鉴定

    构建的hTERTpGL3Basic用PCR法扩增hTERT，得到约267bp的片段，与预期结果一致；用MluⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到约255bp和4.8kb大小的DNA片段，与预期结果一致，见图1。

    2.3   hTERT启动子转录活性的检测

    以pGL3Control为阳性对照（100％），hTERT在各细胞中的相对转录活性见表1，hTERT启动子在HLF细胞中仅有背景转录活性，在SGC7901细胞中显示了较高的转录活性，为阳性对照的(21.50±2.15)％。表1   hTERT启动子转录活性 BasicSGC7901100％(21.50±2.15)%(0.51±0.07)%HLF100％(0.40±0.07)%(0.34±0.04)%

    2.4   hTERTCD:UPRT表达载体的构建及鉴定

    构建的hTERTCD:UPRT用PCR法扩增hTERT，得到约267bp的片段，与预期结果一致；用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ作双酶切鉴定，得到约255bp和6.4 kb大小的片段，与预期结果一致，见图2。

    2.5   RTPCR检测CD基因的表达

    结果显示SGC7901/pcDNA3.1CD:UPRT、SGC7901/hTERTCD:UPRT、HLF/pcDNA3.1CD:UPRT组扩增出约152bp的CD基因产物，HLF/hTERTCD:UPRT和阴性对照组无CD基因的表达，见图3。

    2.6   Western blot检测CD基因的表达

    结果显示SGC7901/pcDNA3.1CD:UPRT、SGC7901/hTERTCD:UPRT、HLF/pcDNA3.1CD:UPRT组有相对分子量约为4.2kD的CD:UPRT融合蛋白的表达，HLF/hTERTCD:UPRT和阴性对照组无CD:UPRT的表达,见图4。

    1: SGC7901/pcDNA3.1CD:UPRT；2: SGC7901/hTERTCD:UPRT；3: SGC7901；4: HLF/pcDNA3.1CD:UPRT；5: HLF/hTERTCD:UPRT；6: HLF

    图4   Western blot检测CD:UPRT的表达

    2.7   MTT法检测细胞存活率

    5FC对转染hTERTCD:UPRT的SGC7901细胞显示明显的杀伤作用，5FC为400μg/ml时细胞存活率仅为10.21%，对转染hTERTCD:UPRT的HLF细胞无明显杀伤作用；而5FC对转染pcDNA3.1CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞均显示明显的杀伤作用，见图5。

    图5   不同浓度的5FC对各组细胞的杀伤作用

    3   讨论

    自杀基因疗法之所以受到人们重视，原因之一是其强大的旁观者效应。旁观者效应使得转基因细胞被杀死的同时，周围大量未转基因的细胞亦被杀死[3,4]，这就解决了基因治疗的一个主要障碍即基因转移的效率问题。

    CD:UPRT/5FC自杀基因系统是通过CD酶（cytosine deaminsae，胞嘧啶脱氨酶）将无毒的5FC转化为有毒的5Fu，5Fu在体内经一系列酶促反应转变成5FUMP（5fluorouridine monophosphate），再进一步形成FUTP和FdUMP，进而干扰RNA和DNA的合成，发挥抗肿瘤作用。UPRT是来源于细菌等微生物中的一种嘧啶补救酶，能直接催化5Fu转化为5FUMP，减少多种竞争酶对5Fu降解，而提高5Fu的疗效[5,6]。ChungFaye等[7]研究发现转染CD:UPRT基因和转染CD基因的结肠癌细胞相比，前者对5FC的敏感性是后者的100倍，且显示出更强的旁观者效应。

    靶向性是基因治疗关键问题之一。端粒酶在大部分正常体细胞中表达为阴性[8]，而在约85％的人类恶性肿瘤中端粒酶激活[9]。hTERT是端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性的主要决定因素。在端粒酶的激活过程中，hTERT在细胞中的表达是决定端粒酶活性的限速步骤[2]。hTERT的表达调控主要发生在转录水平，其转录起始位点上游近端约181bp为核心启动子区域，为hTERT转录激活所必需[10]。因此hTERT启动子可用于肿瘤的靶向基因治疗。

    本研究中，我们扩增了hTERT基因ATG上游120～ 369之间的249bp的启动子序列，包含了上述的核心启动子区域。通过荧光素酶报告基因系统进行启动子活性分析，结果显示在端粒酶阳性的SGC7901细胞中hTERT启动子活性显著增高，为阳性对照pGL3control的(21.50±2.15)%，而在端粒酶阴性的HLF细胞中仅有背景活性，证实hTERT启动子可以调控下游基因在端粒酶阳性的细胞中特异性表达。

    进一步的研究显示，在转染CMV启动子调控的pcDNA3.1CD:UPRT后，SGC7901和HLF细胞中均有CD基因的表达，对5FC敏感，说明CMV启动子不具有肿瘤特异性；而在转染hTERTCD:UPRT后，仅SGC7901细胞中检测出CD基因的表达，且对5FC敏感，在HLF细胞中则无CD基因的表达，对5FC亦不敏感，这说明hTERT启动子具有肿瘤特异性，能调控CD:UPRT基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达，且其活性较强，与CMV启动子调控的CD:UPRT对SGC7901细胞的活性大致相当。

    在以hTERT启动子调控的靶向基因治疗中，人们担心其对体内某些端粒酶表达阳性的正常细胞如生殖细胞、造血干细胞、活化的淋巴细胞的毒副作用。Gu等[11]构建了hTERT启动子调控下的bax基因腺病毒表达载体，并对实验小鼠进行了为期半年的观察，发现小鼠的造血系统及肝脏并无明显异常，同时他们还发现正常人骨髓CD34+造血祖细胞中hTERT启动子活性很低，接近背景水平，所以认为该系统潜在的干细胞相关毒性有限。Kuppuswamy等[12]的研究也证实hTERT的相关毒性较小。

    因此我们认为人端粒酶逆转录酶启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5FC能靶向性杀伤胃癌细胞，为胃癌的治疗提供了另一种选择。

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