丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用

作者：王章桂    作者单位：230032 合肥，安徽医科大学第一附属医院肿瘤科；2.安徽医科大学附属省立医院肿瘤科

    【摘要】  目的 探讨丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用。方法 采用MTT法测定丹皮酚、阿霉素及丹皮酚联合阿霉素体外对HepG2细胞的增殖抑制率；采用两药相互作用指数评价两药相互作用性质；流式细胞仪检测细胞凋亡；原位细胞凋亡检测法观察细胞凋亡形态学变化；Western blot分析Bcl2、Bax变化。结果 不同浓度的丹皮酚、阿霉素及联合用药对HepG2细胞株均有增殖抑制作用，呈剂量依赖性。丹皮酚在31.25mg/L分别与阿霉素在0.16、0.31mg/L联合应用时协同作用最为显著（CDI<0.7）。流式细胞仪检测联合用药组凋亡率(37%)明显高于对照组和单独用药组。TUNEL染色可见典型的凋亡形态学特征。Western blot分析表明单独用药和联合用药组Bcl2表达降低，Bax表达上调，Bcl2/Bax比值降低。结论 一定浓度的丹皮酚能增强阿霉素在体外对HepG2细胞株的增殖抑制作用，其作用机制为通过降低Bcl2表达，上调Bax表达，使得Bcl2/Bax比值降低诱导凋亡实现的。

    【关键词】  丹皮酚 阿霉素 HepG2 细胞增殖 凋亡

    肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，大多数患者在确诊时已属中晚期，失去手术机会。阿霉素是肝癌化疗的一线用药，然而其有效率低于20%,并且血液系统毒性和胃肠道反应十分明显[1]。因此努力寻找有效的药物和最优化的治疗方法是当前的研究重点。

    丹皮酚（paeonol，Pae）又称牡丹酚，是毛莨科植物牡丹根皮和萝摩科植物徐长卿干燥根或全草的主要有效成分。研究表明，丹皮酚不仅对多种肿瘤细胞株均有一定的增殖抑制作用，而且能增强顺铂对人肝癌细胞HepG2和SMMC7721的增殖抑制作用[24]。

    本研究通过观察丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用，并探讨其可能的机制，为肝癌的临床治疗提供理论基础。

    1   材料与方法

    1.1   药品及试剂

    Pae 注射液购于上海第一制药厂；注射用盐酸多柔比星（doxorubicin, Dox）购自深圳万乐药业有限公司；DMEM培养粉、胎牛血清、胰蛋白酶购于美国Hyclone 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）和鼠抗人Bax、Bcl2购于美国Sigma公司；TUNEL购于Promegar公司；BCA protein assay kit 由Pierce公司提供。

    1.2   主要仪器设备

    Nacpo6100 CO2培养箱(美国杜邦公司产品)；YJ1450 型医学净化工作台(苏州净化设备公司)；倒置式显微镜(OLYMPUS)；EL301 Strip reader（酶标仪）(美国BWTek 公司)；

    1.3   细胞系

    人肝癌细胞株HepG2购于上海肝癌研究所。

    1.4   实验方法

    1.4.1   细胞培养及细胞悬液的制备   人肝癌细胞HepG2培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5%CO2的培养箱，取对数生长期细胞用于实验。

    1.4.2   肿瘤细胞体外增殖抑制实验[5]   采用MTT法，设实验组、细胞对照组和空白对照组。实验组每孔分别加入200μl 培养液稀释的药物（Pae 的终浓度为7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00mg/L，Dox的终浓度为0.16、0.31、0.63、1.25、2.50mg / L，两药合用的比例为1∶1 方案），细胞对照组和空白对照组只加入等量的培养液，在酶标仪上用570nm 测定吸光值（A）。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率(IR)=（1-实验组A值/细胞对照组A值）×100%。以药物浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘出生长抑制曲线。以药物浓度的对数与抑制率进行直线回归并求出IC50。

    1.4.3   药物联合作用评价[6]   采用两药相互作用指数（coefficient of drug interaction，CDI）评价两药相互作用性质，CDI按下列公式计算：CDI=AB/（A×B）。根据活细胞数（吸光值）进行计算，AB为两药联合组与对照组吸光值的比值；A或B是各药物单独使用组与对照组吸光值的比值。当CDI<1时两药作用性质为协同；当CDI<0.7时，协同作用非常显著；CDI=1则两药作用性质为相加；CDI>1则两药作用性质为拮抗。

    1.4.4   流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化   将未处理及药物处理的肝癌细胞收集到试管中（细胞数5×105～ 1×106），1 200r/min离心10min，弃上清，用PBS漂洗2遍，按DNAPrepReagents Kit说明书操作，依次加入膜穿孔剂、溴化乙啶(propidium iodide, PI )和RNA酶染色，室温避光放置30min，过400目筛网，上流式细胞仪，激发波长488nm测定细胞周期及细胞凋亡率。

    1.4.5   原位细胞凋亡检测(TUNEL)   将细胞接种于6孔板中（含多聚赖氨酸处理过的盖玻片），置37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜，药物作用48h后取出细胞爬片。4%多聚甲醛固定25min后，按TUNEL说明书操作，DAB 显色，对比染色，脱水透明后封片观察。实验同时设阳性和阴性对照，普通光镜下观察，随机选取5个高倍视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比值,作为凋亡指数(apoptosis index, AI)。

    1.4.6   Western blot检测Bcl2/Bax表达水平   细胞经药物处理48h后，用预冷PBS冲洗2次，加入RIPA缓冲液（150mmol/L  NaCl，1% NP40，0.5% deoxycholic acid，0.1% SDS，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris，pH 8.0）匀浆抽提蛋白，BCA 法蛋白定量，加入上样缓冲液后，进行SDSPAGE电泳，蛋白含量约为40μg/孔，将蛋白转移到PVDF膜，丽春红S 染色，以含5%脱脂奶粉的PBS封闭2h，分别加入鼠抗人Bcl2、Bax，4℃孵育过夜，PBS洗膜加入相应的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃ 孵育2h，ECL显色，观察各条带深浅变化并加以分析,βactin作为对照。

    1.5   统计学方法

    应用SSPS10.0软件进行统计学分析。使用±s、KruskalWallis秩和检验和Pearson相关进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2   结果

    2.1   丹皮酚和阿霉素单独应用对HepG2细胞的增殖抑制作用

    Pae在7.81～ 250mg/L浓度范围内对HepG2细胞株有增殖抑制作用，抑制率随着药物浓度的升

    高而增加，Pae在7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00mg/L浓度时对HepG2抑制率依次为：0.93%、14.21%、16.87%、40.13%、78.69%、98.79%。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析：r＝0.9637，P<0.01。IC50为58.943±2.457。

    系列浓度的Dox (0.16、0.31、0.63、1.25、2.50mg/L)单独应用时对HepG2细胞的增殖均有抑制作用，抑制率依次为18.36%、33.53%、61.55%、74.89%、 77.03%。药物浓度越高，抑制作用越强，呈现明显的剂量依赖效应关系。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析：r=0.9643，P<0.01。IC50为0.543±0.097。

    2.2   丹皮酚和阿霉素联合应用对HepG2细胞的增殖抑制作用

    三种浓度的Pae(15.63、31.25、62.50mg/L)与不同浓度的Dox联合应用作用于HepG2细胞时，均可观察到其协同增殖抑制作用，见图1。CDI分析表明，与Pae联合应用时，Dox在0.16、0.31mg/L时即显示出协同作用（CDI<1）。其中与Pae在31.25mg/L联合应用时其协同作用最为显著（CDI<0.7），其CDI分别为0.656、0.635，联合用药组与同等剂量Dox单独用药组相比差异有显著性（P<0.01）。然而，当Dox浓度升高到0.63、1.25mg/L时则产生拮抗作用，与31.25mg/L Pae联合应用时其CDI分别为0.930、1.097；与62.5mg Pae联用时其CDI依次为1.047、1.304，见图2。

    2.3   丹皮酚和阿霉素的凋亡诱导作用

    G1期前出现的亚G1期代表着凋亡细胞数。FCM分析表明给药组较对照组相比，可见明显的亚G1期，其中以联合用药组的凋亡峰最为显著，其凋亡率高达37%，同对照组和单独用药组相比P<0.01，见图3。

    典型的凋亡细胞表现为染色质凝集、边集化，呈新月形聚集于核膜下。 因切面的不同，凝集的染色质以不同形态散在于核切面的任意位置，或以圆形位于核膜下，或位于核中央。TUNEL染色发现在对照组有少许细胞核深染为棕褐色的凋亡细胞。在阿霉素和丹皮酚单独用药组以及联合用药组凋亡细胞数依次增多，以联合用药组最为显著，见图4。

    2.4   丹皮酚和阿霉素对Bcl2和Bax表达的影响

    Western blot分析表明，在丹皮酚和阿霉素单独用药组，Bcl2表达明显降低，Bax表达增加，Bcl2/Bax的比率在给药组均有不同程度的降低，以联合用药组最为显著，见图5。

    3   讨论

    肝癌是中国和撒哈拉非洲地区最常见的肿瘤之一。近年来，其发生率在发达国家也有上升的趋势[7]。由于肝癌患者对抗肿瘤药物并不敏感，同时化疗药物的剂量又受到肝功能的限制，因此，化疗在肝癌治疗中并未起到重要的作用。但是那些对手术、动脉栓塞和其他一般疗法无效或复发的晚期患者，化疗却是一种重要的可供选择的方法之一。然而，到目前为止，还没有发现任何一种单药或联合方案其有效率达到25%[8]。阿霉素是细胞周期非特异性药物，通过将肿瘤细胞阻滞于G2/M期而发挥其直接杀伤作用[9]。本研究表明，在体外试验中丹皮酚和阿霉素以及联合用药对HepG2细胞株均有增殖抑制作用，且呈剂量依赖性。当给予31.25mg/L的丹皮酚联合极低浓度的阿霉素（0.16或0.31mg/L）时，即表现出显著的协同作用（CDI<0.7），并且其对HepG2细胞株的增殖抑制作用显著高于丹皮酚或阿霉素单药组。

    许多研究表明在Bcl2家族的多种成员中，Bcl2是最主要的凋亡抑制基因，而Bax是最重要的激活基因。Bcl2通过BH区域同Bax相结合形成异二聚体以及Bcl2/Bax的比率在阻止Bax调节凋亡的过程中起着重要的作用[10]。Bcl2下调或Bax的上调能促进凋亡[11]。在本研究中，流式细胞分析发现，丹皮酚和阿霉素都能在不同程度上诱导HepG2细胞凋亡，在联合用药时其凋亡率高达37％。这一现象也同时被TUNEL染色所证实。在给药组有大量的凋亡细胞，可见明显的核浓聚、核碎裂。在联合组，凋亡尤为明显。Western blot分析表明，给药后Bcl2表达下调，Bax表达上调，Bcl2/Bax比值降低，以联合用药组为著。

    总之，丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞的增殖抑制有协同作用，其机制可能在于通过下调Bcl2的表达，上调Bax表达，使得Bcl2/Bax比值降低诱导凋亡，然而其确切机制还需进一步研究。

【参考文献】[1]  Winnie Y, Tony SM, Benny Z，et al. A Randomized Phase III Study of Doxorubicin Versus Cisplatin/Interferon α 2b/Doxorubicin/Fluorouracil (PIAF) Combination Chemotherapy for Unresectable Hepatocellular Carcinoma[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2005,97(20): 15321538.

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[3]徐淑萍，孙国平，王华，等.丹皮酚增强顺铂对人肝癌细胞SMMC7721的增殖抑制作用[J].安徽医科大学学报，2006,41(1):6365.

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[10]Zhang CL, Wu LJ, Tashiro S, et al.Oridonin induces apoptosis of HeLa cells via altering expression of Bcl2/Bax and activating caspase3/ICAD pathway[J]. Acta Pharmacol Sin,2004,25(5): 691698.