电离辐射对食管癌细胞周期及MDC1、53BP1蛋白表达的影响

作者：祝淑    作者单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院放疗三病区     【摘要】  目的 观察60Co γ射线照射后食管癌细胞周期、细胞凋亡及其相关蛋白表达的变化，为食管癌放射治疗、靶向治疗提供理论依据。方法 食管癌细胞株TE13进行不同剂量（0、1、2、5、10、15Gy）照射后，应用流式细胞术分别检测照射后1、2、12、24和48h细胞周期和凋亡指数的变化；同时采用Western blot方法检测MDC1和53BP1蛋白表达情况。结果 TE13细胞照射后12、24、48h，TE13细胞的G0/G1期、G2/M期和S期的变化呈现明显剂量依赖性，1Gy和2Gy照射后12h，细胞G2/M期阻滞开始出现；5、10、15Gy照射后24h，细胞G2/M期阻滞最为明显，与对照组（0Gy组）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；15Gy照射后12h、24、48h，TE13细胞的凋亡增加非常显著（P<0.01）；不同剂量照射后1、2、24h，TE13细胞MDC1和53BP1蛋白表达未见明显变化（P>0.05）。结论 TE13细胞经不同剂量放射线照射后，细胞周期出现明显的G2/M期阻滞，细胞凋亡指数明显增加，但对MDC1和53BP1蛋白表达未见明显影响。

    【关键词】  电离辐射 食管 细胞周期 凋亡 MDC1 53BP1

    电离辐射引起细胞DNA损伤后，细胞停滞于G2/M期、G0/G1期和S期的检测点，进行DNA损伤后修复，以维持基因组的完整性和稳定性。细胞周期检测点激酶MDC1（DNA损伤检测点介质1，mediator of DNA damage checkpoint 1）和53BP1（p53结合蛋白1，p53binding Proteins 1）在DNA损伤后激活并向下游靶蛋白传递信号，使细胞周期进程发生阻滞，促进损伤DNA的修复。本实验应用流式细胞术和免疫印迹（Western blot）方法，研究60Co γ射线照射后对细胞周期及MDC1、53BP1蛋白表达的影响，旨在阐明MDC1和53BP1蛋白表达在照射后细胞周期中的调控作用。

    1   材料和方法

    1.1   主要材料

    食管癌细胞株TE13由我院科研中心提供；兔抗人MDC1多克隆抗体(英国Abcam公司)；鼠抗人53BP1单克隆抗体(美国Chemicon公司)；碱性磷酸酶标记的IgG羊抗兔、羊抗鼠二抗及βactin抗体(北京博奥森生物公司)；BCIP/NBT底物显色试剂盒(美国Ameresco公司)；蛋白提取试剂(北京赛百盛公司)；流式细胞仪（FCM，EpicsXL Ⅱ型）为Beckman Coulter公司生产，60Co治疗机（FCC8000C型）为山东新华医疗器械公司生产。

    1.2   细胞培养

    常规方法传代培养，TE13细胞培养采用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，内含青霉素100u/ml和链霉素100u/ml 。置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，每2～3天传代1次。

    1.3   细胞照射

    (1)对数生长期细胞采用60Co γ射线照射0、1、2、5、10、15Gy后1、2、12、24、48h收集细胞，70%冰乙醇固定，4℃保存备用，每个剂量点和时间点各重复3次，以增加结果的可比性。(2)细胞照射0、1、2、5、10Gy后1、2、24h提取细胞总蛋白，考马斯亮兰法蛋白定量后，-80℃保存备用。

    1.4   流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和凋亡指数

    上述冰乙醇固定细胞PBS洗涤3 次，并稀释至1×105个细胞/ml，每份样品加入鸡血红细胞悬液15μl（作为DNA含量内参照标准）加入碘化丙啶（50mg/ml PI，1% triton×100）1ml， 4℃染色30min，上机检测，Muticycle AV软件分析细胞周期并测定凋亡指数（AI）。鸡血红细胞作为内参照。

    1.5   Western blot检测相关蛋白的表达

    上述提取的细胞总蛋白采用7.5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉37℃摇床封闭1h后，加入MDC1和53BP1抗体(1∶100)，4℃孵育过夜，TBS洗膜，碱性磷酸酶标记的二抗37℃摇床孵育1h，TBS洗膜，BCIP/NBT法避光室温显色。图像扫描仪扫描，定量软件分析系统测定每一样本条带的OD值，目的条带的OD值与βactin条带OD值的比值视为该样本中蛋白的相对表达量，同一种细胞重复3次求其均值代表该细胞蛋白的表达水平。

    1.6   统计学方法

    运用SPSS11.5统计软件包分析，数据分析采用重复测量资料的方差分析。

    2   结果

    2.1   食管癌细胞照射后细胞周期和细胞凋亡的变化

    2.1.1   不同剂量的放射线照射后不同时间对G0/G1期细胞百分数的时程变化

    从表1可见照射后1、2h， G0/G1期TE13细胞百分率无明显变化；照射后12h，各剂量组的G0/G1期比例显著下降，与对照组（0Gy组）比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而且随着放射线剂量的增加，细胞G0/G1期的比例呈现进行性降低(P＜0.05)；照射后24h，5～ 15Gy组G0/G1期细胞百分率明显低于对照组(P＜0.05)，但1Gy组G0/G1期细胞百分数与对照组相比有增高趋势(P＞0.05)；照射后48h，1、2Gy组的G0/G1期细胞百分率基本恢复正常，5、10、15Gy剂量组G0/G1期细胞百分率开始回升，但与对照组比较，仍明显降低(P＜0.05)。

    2.1.2   不同剂量的放射线照射后不同时间对G2/M期细胞百分数的时程变化

    表2显示，不同剂量照射后1、2h，TE13细胞G2/M期细胞百分率无明显变化；照射后12h，各剂量组G2/M期明显升高，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，除2Gy和5Gy组外，其余各剂量组之间比较差异也具有统计学意义(P＜0.05)；照射后24h，除1Gy组外，其余各组的G2/M期细胞百分率仍然较高，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，且随着放射线剂量的增加，G2/M期阻滞越为严重(P＜0.05)；照射后48h，除1Gy组外，其余各组与对照组比较仍然较高且差异有明显统计学意义(P＜0.05)，并且随着放射线剂量的增加，G2/M期阻滞越为严重(P＜0.05)。

    2.1.3   不同剂量的放射线照射后不同时间对S期细胞百分数的时程变化

    表3显示，照射后1、2h，TE13 细胞S期比例无明显变化；照射后12h，除1Gy组外，其余各剂量组S期细胞百分数明显降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；照射后24h，各剂量组S期的比例仍处于低水平状态，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，总体趋势表现为随着放射线剂量的增加，S期的比例降低越明显；照射48h后，除1Gy组外，其余各组S期的比例仍然较低，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，但5、10、15Gy组之间S期的比例并无明显差别，此时，1Gy组S期的比例与5、10、15Gy组比较明显升高且有统计学意义(P＜0.05)。

    2.1.4   不同剂量的放射线照射后TE13细胞凋亡的时程变化

    表4显示，照射后1、2h，TE13细胞凋亡指数无明显变化；照射后12、24h，TE13细胞只有在15Gy组凋亡指数明显增加(P＜0.05)，其余剂量组无明显变化；继续观察至照射后48h，5、10和15Gy组细胞凋亡明显增加，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，而其余各组变化不明显(P＞0.05)。

    2.2   食管癌细胞照射后细胞周期相关蛋白表达的变化

    分别观察并检测了0、1、2、5、10Gy照射后1、2、24h TE13细胞中MDC1、53BP1蛋白表达的情况，结果显示各剂量组的两种蛋白表达在照射后不同观察时间内未见明显变化，见表5、6，图1～ 3。表1   TE13细胞照射后不同时间G1期的变化表2   TE13细胞照射后不同时间G2/M期的变化表3   TE13细胞照射后不同时间S期的变化表4   TE13细胞照射后不同时间细胞凋亡的变化表5   TE13细胞照射后不同时间53BP1蛋白表达的变化表6   TE13细胞照射后不同时间MDC1蛋白表达的变化

    3   讨论

    细胞周期阻滞是机体对外界损伤最普遍的适应性反应。食管癌细胞株TE13经不同剂量放射线照射后1、2h细胞周期未见明显变化，但当照射后超过12h时，随放射线剂量的增加，呈现进行性的G0/G1和S期比例降低，G2/M期增加，即出现明显G2/M期阻滞，而且阻滞的严重程度随照射剂量的增加而加重，这与van Oostrum等[1]的研究结果相符。细胞照射后出现明显G2/M期阻滞而无G0/G1期阻滞，可能与p53突变有关[2]。本研究中TE13细胞经不同剂量放射线照射后不同时间，G2/M期变化表现为1、2Gy照射后12h，阻滞最为严重，其后开始逐渐解除，直到照射后24h，1Gy组细胞周期已基本恢复正常，而5、10、15Gy组G2/M阻滞最严重出现在照射后24h，其后阻滞才开始缓慢解除，见表2，由此可认为细胞周期阻滞在较低剂量照射后消退较快，而在较高剂量照射后消退较慢甚至不消退。Li等[3]报道人结肠癌和宫颈癌细胞照射后G2/M期细胞阻滞也呈剂量依赖性，他发现2Gy照射后仅短暂阻滞，而4和6Gy照射后G2/M期阻滞时间分别为48h和72h，该报道与本研究结果一致。

    从放射生物学角度讲，处于G2/M期的细胞放射敏感性最高，但是照射后G2/M期阻滞加重是增加放射敏感性，还是增加放射抗拒性，文献报道不一。Pomp等[4]报道恶性黑色素瘤细胞转染突变Nras基因使细胞照射后G2/M期阻滞延长，细胞放射敏感性增加；但Chen等[5]报道AT细胞转染CHK1基因使照射后G2/M期阻滞加重反而增加了放射抗拒性；Furre等[6]报道增加人乳腺癌细胞T47D照射后G2/M期阻滞，并没有增加放射敏感性。我们拟在下一步研究中采取RNA干扰技术降低G2/M期阻滞，来观察细胞放射敏感性的变化，以进一步探讨G2/M期阻滞和食管癌细胞放射敏感性的关系。

    本研究发现TE13细胞在照射后12h和24h，只有放射线的剂量达到15Gy时细胞凋亡才明显增加，而在照射后48h，TE13细胞只要接受≥5Gy照射即可出现明显的细胞凋亡，见表4，说明TE13细胞接受的放射线剂量越高，细胞凋亡出现的时间越早。进一步观察并分析，发现细胞凋亡基本上是在G2/M期阻滞开始解除的时刻开始增加，提示细胞凋亡可能是G2/M期阻滞进一步发展的结果。同p53引起的G0/G1期阻滞类似，辐射引起G2/M期阻滞，以便修复损伤的DNA，如果细胞DNA损伤得以修复，则进入下一个细胞周期，否则就会发生细胞凋亡。所以通过调节G2/M期阻滞的时间就有可能调控细胞凋亡，在这方面的深入研究对提高肿瘤的放疗效果具有重要意义。

    研究表明，照射后G2/M期阻滞与DNA损伤修复有关。Ng等[7]报道G2/M阻滞时间与潜在致死性损伤修复呈负相关；Raju等[8]认为G2/M期阻滞与照射后亚致死性损伤修复有关。因此，促使照射后G2/M期细胞进入有丝分裂期，从而增加放射敏感性是目前抗肿瘤治疗研究的热点[9]。DNA损伤尤其是DNA双链损伤后，细胞周期检查点能迅速感应并及时向下游传导和放大损伤信号，以促进DNA损伤修复系统对DNA受损处进行修复，维持DNA的稳定性和完整性。细胞周期检查点激酶MDC1和53BP1蛋白是新近发现的DNA损伤修复通路中两个非常重要的蛋白激酶，放射线引起DNA损伤发生后，MDC1和53BP1蛋白能够迅速被ATM活化，及时把损伤信号传递给下游的效应分子CHK1、CHK2，CHK2激酶第68位苏氨酸（T）磷酸化而被激活。活化的CHK2对细胞周期G1/G0、S和G2/M 期检查点进行调控，促进DNA损伤修复以保证细胞基因组的完整和稳定[10]。本研究发现，单纯照射后1、2、24h，TE13细胞中MDC1和53BP1蛋白表达未见到明显变化，但我们前期研究已经发现照射后细胞CHK2 T68磷酸化水平出现时相性改变[11]，因此MDC1和53BP1很可能是通过磷酸化CHK2 T68 激活CHK2而向下游传导和放大DNA损伤信号[12]。

    细胞周期阻滞是多数肿瘤细胞照射后普遍的反应规律，如果利用RNA干扰技术，消除照射后细胞周期阻滞，抑制DNA损伤修复，即可增加放射线对肿瘤细胞的杀灭作用，从而提高放射敏感性。

【参考文献】[1] van Oostrum IE,ErkensSchulze S,Petterson M,et al. The relationship between radiosensitivity and cell kinetic effects after low and highdoserate irradiation in five human tumors in nude mice[J]. Radiat Res,1990,122(3):252261.

[2] Bohnke A,Westphal F,Schmidt A,et al. Role of p53 mutations,protein function and DNA damage for the radiosensitivity of human tumour cells[J]. Int J Radiat Biol,2004,80(1):5363.

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[4] Pomp J,Ouwerkerk IJ,Hoogstraten C,et al. The influence of the oncogene Nras on cell cycle delay in a human melanoma cell line with reduced radioresistance[J]. Oncol Rep,2000,7(3):663667.

[5] Chen P,Gatei M,O'Connell MJ,et al. CHK1 complements the G2/M checkpoint defect and radiosensitivity of ataxiatelangiectasia cells[J]. Oncogene,1999,18(1):249256.

[6] Furre T,Furre EI,Koritzinsky M,et al. Lack of inverse doserate effect and binding of the retinoblastoma gene product in the nucleus of human cancer T47D cells arrested in G2 by ionizing radiation[J]. Int J Radiat Biol,2003,79(6):413422.

[7] Ng CE,Banerjee SK,Pavliv M,et al. p53 status,cellular recovery and cell cycle arrest as prognosticators of in vitro radiosensitivity in human pancreatic adenocarcinoma cell lines[J]. Int J Radiat Biol,1999,75(11):13651376.

[8]Raju U,Nakata E,Yang P,et al. In vitro enhancement of tumor cell radiosensitivity by a selective inhibitor of cyclooxygenase2 enzyme: mechanistic considerations[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,2002,54(3):886894.

[9] Kawabe T. G2 checkpoint abrogators as anticancer drugs[J]. Mol Cancer Ther,2004,3(4):513519.

[10]Peng A,Chen PL. NFBD1,like 53BP1,Is an early and redundant transducer mediating Chk2 phosphorylation in response to DNA damage[J]. J Biol Chem,2003,278(11):88738876.

[11]王玉祥，祝淑钗，封巍，等. CHK1和CHK2shRNA转染对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响[J].中华肿瘤杂志,2006,28(8):572577.

[12]Ahn JY,Li X,Davis HL,et al. Phosphorylation of threonine 68 promotes oligomerization and autophosphorylation of the CHK2 protein kinase via the forkheadassociated domain[J]. J Biol Chem,2002,277(22):1938919395.