人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备

作者：杨健    作者单位：637000 四川南充，川北医学院免疫学与分子生物学研究所     【摘要】  目的 克隆表达重组人生存素，制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法 用RTPCR方法从培养的人白血病细胞株HL60中克隆人生存素 cDNA，克隆到原核表达载体pET32a（+），重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，目的蛋白经NiNTA 树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清，ELISA检测抗血清的效价，Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性。结果 所克隆生存素 cDNA序列与Genbank中序列完全一致，将其读码框插入原核表达载体pET32a（+）诱导表达后，SDSPAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白，表达量占总菌体的30%，纯化后融合蛋白的纯度为95%，所制备的鼠抗血清的效价达1∶1 600，Western blotting证实其有较好的特异性，可以检测肿瘤细胞生存素的表达。结论 我们已克隆并表达了人生存素基因，所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测。

    【关键词】  生存素 抗血清 融合蛋白

    生存素是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族的成员之一，其分布显著不同于其他的凋亡抑制蛋白，它主要表达于胚胎和发育的胎儿组织，未见于终末分化的成人组织(胸腺和生殖腺除外)，而大多数肿瘤及癌前病变有不同程度表达，癌旁组织不表达[1]。另外，有研究发现生存素表达与肿瘤的预后及耐药高度相关[25]，因此，生存素是一个与肿瘤关系密切的分子。本实验克隆人生存素基因，构建人生存素原核表达载体，免疫小鼠制备人生存素抗血清，为通过免疫技术检测生存素的表达奠定基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    原核表达载体pET32 a (+)、大肠杆菌BL21(DE3)购于Novagen公司；pGEMT Easy购于Promeg公司；HL60细胞、胃癌细胞株SGC7901和胰腺癌细胞株PANC1由本室保存，总RNA提取试剂盒与NiNTA 树脂购于德国Qiagen公司；限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、RTPCR反应体系、cDNA合成试剂盒均购于立陶宛MBI公司；胶回收试剂盒HB101购于美国Q.BIOgene公司；质粒抽提试剂盒购于上海华舜生物有限公司；测序由上海基康生物有限公司完成；DNA marker(λ/EcoT14、DL2000)、蛋白质marker购于大连宝生物有限公司；HRP标记的羊抗鼠抗体购于Santa Cruz公司。

    1.2  方法

    1.2.1  人生存素基因的克隆及测序

    以RPMI1640复合培养液培养HL60细胞至2×107，以100U/ml的rhIL3刺激24h后，收集细胞并以PBS缓冲液洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，电泳检测RNA的量与纯度；按RTPCR扩增试剂盒参考说明，先合成cDNA，接着进行PCR扩增；人生存素引物P1：5′TAGGATCCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTG3′，下划线为BamH Ⅰ酶切位点，P2：5′GCAAGCTTATCCATGGCACCAGCTGCTC3′，下划线为Hind Ⅲ酶切位点；热循环程序为：94℃  3min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃  1min，30个循环，72℃ 7min；2%琼脂糖电泳检测；PCR产物经回收纯化后插入pGEMT Easy载体并进行DNA测序，将序列完全正确的克隆命名为pGEMT Easy生存素，并提取质粒备用。

    1.2.2  pET32survivin载体构建并进行酶切鉴定

    分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切测序正确的pGEMT Easy生存素和pET32 a（+）载体，胶回收酶切后的生存素cDNA片段和线性载体pET32 a（+），以3∶1的比例于16℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，挑取阳性重组克隆提取质粒进行酶切鉴定，命名阳性克隆为pET32生存素。

    1.2.3  工程菌的诱导表达

    将pET32生存素转化CaCl2处理的感受态细胞E.coli BL21(DE3)，将工程菌接种于含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养，当OD(600nm)约为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L。在相同条件下继续培养3h，离心收集菌体，用20mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)洗涤后，进行超声破碎制备包涵体与SDSPAGE分析。

    1.2.4  融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

    以8M尿素溶解包涵体后，加入NiNTA树脂，上柱后用不同pH值的洗脱缓冲液分步洗脱，以SDSPAGE检测目的蛋白纯度。选取10只8周龄健康的Balb/c雄性小鼠，第1周于小鼠足垫注射0.1ml/只弗氏完全佐剂后分为两组，第一组于第2周于皮内注射50μg/只乳化的蛋白质，第3、4周于皮下注射30μg/只纯化蛋白，第二组注射生理盐水作为对照。末次免疫后3d以眼球摘除法取血，分离血清，分装后-20℃保存。

    1.2.5  抗血清的效价检测和特异性检测

    采用间接ELISA法测定鼠抗重组人生存素血清的效价。以每孔100μl含10μg/ml重组人生存素的包被液4℃过夜包避微量反应板后，5%脱脂奶进行封闭，用不同稀释度的抗重组人生存素血清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，ABTS为底物进行反应，BioRad 550酶标仪进行读数测定。

    抗血清特异性鉴定用Western blot法分析。工程菌总蛋白和纯化后目标蛋白进行SDSPAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，滴加5%脱脂奶粉封闭2h，依次用1∶500的抗重组人生存素血清为一抗，1∶2 000的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗， DAB为底物进行反应。

    1.2.6  抗重组人生存素血清检测肿瘤细胞

    分别培养的胃癌细胞SGC7901、胰腺癌肿瘤细胞PANC 1并制备爬片，以1∶500的抗重组人生存素血清为一抗，1∶2 000的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗， DAB为底物进行识别，判断所制备的抗重组人生存素血清的免疫组化识别活性。

    2  结果

    2.1  RTPCR扩增人生存素基因

    从rhIL3刺激后的HL60细胞制备总RNA，用所设计引物以RTPCR扩增生存素cDNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出大小约450bp的cDNA片段，见图1。与理论值相符，将其重组入pT easy质粒载体，经上海基康生物技术公司进行双向测序，结果与Genbank中人生存素基因序列完全一致。

    2.2  表达质粒的酶切鉴定

    将扩增的人生存素cDNA用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，定向重组入原核表达质粒pET32a（+）的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ位点，挑取阳性重组子pET32survivin进行限制性核酸内切酶谱分析：阳性重组质粒DNA经BamH Ⅰ与Hind Ⅲ单酶切而线性化，双酶切后释放出大小约450bp的片段，与所插入片段的大小相同，见图2。

    2.3  重组人生存素的表达及鉴定

    将pET32生存素重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21，在IPTG诱导下表达，将诱导表达前后的细菌总蛋白进行SDSPAGE电泳，诱导后可表达大小约37 KD左右的TrxHis人生存素的融合蛋白，见图3。以可溶性蛋白和包涵体同时存在，蛋白表达量大约占菌体蛋白质总量的30%左右，经NiNTA 树脂纯化后，重组TrxHis人生存素纯度可达95%。

    2.4  抗血清效价检测和特异性检测结果

    以纯化后的重组TrxHis人生存素包被微量反应板，间接ELISA法检测所制备的鼠抗重组TrxHis人生存素血清的效价，以正常鼠血清为阴性对照，按阳性OD与阴性OD的比值为2.1进行判断，所制备抗血清效价为1∶1 600。将表达TrxHis人生存素的重组菌全菌蛋白和通过NiNTA柱纯化后的TrxHis人生存素进行SDSPAGE电泳，电转移至硝酸纤维滤膜上，以制备的抗重组TrxHis人生存素血清为一抗，HRP羊抗鼠IgG为二抗进行识别，见图4，所制备的鼠抗重组TrxHis人生存素血清的识别条带为重组TrxHis人生存素特异性条带。

    2.5  免疫组化的实验结果

    以抗重组TrxHissurvivin血清为一抗，以免疫细胞化学检测培养细胞发现，抗血清可以识别胃癌细胞株SGC7901和胰腺癌细胞株PANC1，证实生存素主要分布于细胞浆，在胞核中未见表达，见图5。而用生理盐水免疫动物血清作为一抗检测，未发现有阳性染色。

    3  讨论

    发展免疫细胞化学方法对肿瘤进行病理学诊断具有十分重要意义。人生存素主要表达于肿瘤细胞及其他增殖分化旺盛的细胞，Zhang等[6]认为生存素是细胞生物学转化的中间环节，其表达阳性提示组织学尚正常的组织存在癌变的可能，这为早期诊断提供依据。Sharp等[7]以膀胱镜细胞学检查与检测尿液中生存素诊断膀胱癌，认为细胞学检查虽有特异性，但花费高、有创伤且灵敏性较低，而检测生存素的表达对新发现或复发膀胱癌的灵敏度达100％，对其他新生物和非赘生物性泌尿生殖系疾病的特异性达95％。Ikeguchi等[8]认为检测生存素表达可以预测肝癌术后是否复发，因此通过检测细胞内生存素的表达对特定肿瘤的早期诊断和预后判断具有重要价值。

    我们以pET32a(+)质粒原核高效表达重组人生存素的融合蛋白，制备相应抗体以发展通过免疫组化技术检测生存素表达而检测肿瘤细胞，结果在原核系统中表达出了约37KD大小的survivin与TrxHis的融合蛋白，表达量达总蛋白的30%左右，目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体同时存在，说明硫氧还原蛋白促使目的蛋白正确折叠作用有限，当表达效率增高后，不能完全促使目的蛋白自然折叠。当我们以TrxHis生存素融合蛋白免疫小鼠制备抗血清用于检测生存素表达时，所制备的抗血清不仅效价高，而且通过Western blotting技术和免疫细胞化学技术检测证实，其对人生存素识别的特异性较好，可用于临床肿瘤诊断。 

    【参考文献】[1] Ikeguchi M, Ueta T, Yamane Y, et al. Inducible nitric oxide synthase and survivin messenger RNA expression in hepatocellular carcinoma［J］. Clin Cancer Res, 2002, 8(10): 31313136．

[2] Tonini G, Vincenzi B, Santini D, et al. Nuclear and cytoplasmic expression of survivin in 67 surgically resected pancreatic cancer patients［J］. Br J Cancer，2005, 92(12): 22252232.

[3] Kami K, Doi R, Koizumi M, et al. Survivin expression is a prognostic marker in pancreatic cancer patients［J］. Surgery，2004, 136(2): 443448.

[4] Ku JH, Kwak C, Lee HS, et al. Expression of surviving, a novel inhibitor of apoptosis, in superficial transitional cell carcinoma of the bladde［J］. J Urol, 2004, 171(2): 631635．

[5] Wall NR, Connor DS, Hescia J, et al. Suppression of surviving phosphorylation on Thr34 by flavopiridol enhances tumor cell apoptosis［J］. Cancer Res, 2003, 63(1): 230235.

[6] Zhang SQ, Qiang SY, Yang WB, et al. Expression of survivin in different stages of carcinogenesis and progression of breast cancer［J］. Ai Zheng, 2004, 23(6): 697700．

[7] Sharp JD, Hausladen DA, Maher MG, et al. Bladder cancer detection with urinary survivin, an inhibitor of apoptosis［J］. Front Biosci, 2002, 7: 3641．

[8] Ikeguchi M, Ueda T, Sakatani T, et al. Expression of survivin messenger RNA correlates with poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma［J］. Diagn Mol Pathol, 2002, 11(1): 3340．