全反式维甲酸对结肠癌细胞XIAP相关因子1表达的影响

作者：罗晓勇    作者单位：510282 广州，南方医科大学珠江医院肿瘤中心     【摘要】  目的 了解全反式维甲酸对结肠癌lovo细胞XIAP相关因子1（XAF1）表达及细胞增殖的影响。方法 以不同浓度的ATRA刺激lovo细胞，RTPCR检测XAF1的mRNA水平变化，Western blot分析XAF1蛋白水平的表达；MTT法检测ATRA对lovo细胞生长抑制率。构建含有XAF1启动子序列荧火虫荧光素酶报告质粒，分析ATRA作用对XAF1启动子活性的影响。结果 经ATRA作用，lovo细胞mRNA和蛋白的表达水平上调，细胞生长受到抑制。上述效应均具有药物浓度依赖性。报告基因分析结果显示，ATRA使含有XAF1启动子序列荧火虫荧光素酶报告质粒的虫荧光素酶的活性增加。结论 ATRA通过促进启动子转录活性上调XAF1的mRNA和蛋白表达水平，并抑制结肠癌细胞的生长。

    【关键词】  全反式维甲酸 结肠癌 XIAP相关因子1

    X染色体相关凋亡抑制蛋白(Xchromosomelinked inhibitor of apoptosis, XIAP)是凋亡抑制蛋白家族成员之一，具有抑制细胞凋亡作用［1］。XIAP相关因子1(XIAPassociated factor 1，XAF1)是凋亡抑制因子(lAP)家族成员——XIAP的负向调节蛋白，能拮抗XIAP的抗凋亡作用，是一种新近发现的抑癌基因。全反式维甲酸(alltraps retinoic acid，ATRA)是维生素A的天然衍生物及生物活性形式，能够诱导多种肿瘤细胞分化或抑制肿瘤细胞的增殖。为探讨ATRA对结肠癌细胞XAF1表达及细胞增殖的影响，我们进行了以下研究。

    1  材料和方法

    1．1  材料

    全反式维甲酸（ATRA）、二甲亚砜(DMSO)及甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自Sigma公司；RPM1 1640培养基购自Gibco公司；羊抗人XAFI（C16）、HRP偶合抗羊IgG均购自santa cRaz生物技术公司；结肠癌细胞株lovo来自美国American Type Culture Collection（ATCC）。

    1．2  载体构建

    基因组DNA抽提试剂盒(大连宝生物公司)提取lovo细胞的基因组DNA，Hotstart PCR扩增XAF1基因启动子序列（-107nt～164nt），在这里临近翻译初始密码子ATG上游的核苷酸定义为1。引物序列如下：上游引物5′GATCTCCTCUTCCCTGAA3，下游引物 5′GTCTCCAGCTGCTTGTCCTC3′，Kpn I酶切位点加入到上游引物的5′端，XhoI酶切位点加入到下游引物中。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。用GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kit (Amersham公司)纯化PCR产物，经Kpn I和Xho I分别双酶切载体pGL3 basic载体(Promega公司)和PCR产物后，将纯化的PCR产物插入到pGL3 basic载体的荧光素酶报告基因上游方向上构建成启动子荧光素酶报告质粒（pLUC107）。常规转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素的培养平板上挑选并鉴定阳性克隆。上述质粒经序列测定正确后使用。

    1．3  细胞培养与转染

    结肠癌细胞lovo用含10%胎牛血清，100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素的1640培养液，在5% CO2、37℃环境的培养箱中进行培养，待细胞长满瓶底时传代。

    按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)脂质体转染说明书进行细胞转染操作。将生长状态良好的lovo细胞接种6孔培养板，在37℃、5% CO2培养箱中培养18～20h，与质粒DNA(3μg)和脂质体(6μl)混合后置CO2培养箱4h，4h后更换完全培养基继续培养48h。

    1．4  RTPCR检测XAF1 mRNA的表达

    采用TRizol法提取细胞总RNA。使用Thermoscript RTPCR系统(Invitrogen 公司)进行RTPCR。按厂家说明书进行操作，先将RNA 逆转录成cDNA，在PCR反应体系中含2μl cDNA，0.3单位Hotstart DNA多聚酶， 上下游引物和dNTPs，反应体积50μl。XAF1引物序列如下：上游：5′GCTCCACGAGTCCTACTG3′，下游： 5′ACTCTGAGTCTGGACAAC3′， 扩增片段大小262bp。GAPDH作为内参照，引物序列：上游：5′GTCAACGGATTTGGTCTGTATT3′，下游：5′AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT 3′，扩增片段560bp。Hotstart PCR扩增33个循环， 95℃变性30min（第一循环），94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s和10min（第一循环）。

    1．5  Western blot检测

    细胞离心沉淀并提取蛋白，用蛋白分析试剂盒（Amersham公司）测定蛋白浓度。取20μg蛋白经SDSPAGE变性胶电泳（5%堆积凝胶，12%分离凝胶）后，蛋白质被转移到PVDF(polyvinylidene difluoride membranes)膜上，非特异带用10mol/L含0.05% Tween20、2%脱脂奶、pH 7.6的TrisHCI溶液进行封闭后，先后加入羊抗人XAF1抗体（C16），HRP偶合抗羊二抗，抗原抗体复合物在ECL系统下观察。

    1．6  报告基因检测

    为了解ATRA对XAF1启动子活性的影响，将含有XAF1启动子报告基因质粒（pLUC107）和表达CMV启动子驱动的海肾(Renila)荧光素酶载体pRLCMV与Lipofectamine 2000混合，共转染细胞株，转染后48h，给予ATRA刺激10h后，将细胞与50μl的荧光素酶检测试剂（promega）混合，萤火虫和海肾(Renila)荧光素酶活性用双荧光素酶报告基因系统(Promega)在TD20/20光度计上进行测量，萤火虫荧光素酶活性值以海肾荧光素酶活性为参照进行测量，启动子转录活性用萤火虫荧光素酶表达值/海肾荧光素酶表达值（RLU）的荧光素酶相对活性表示。

    1．7  MTT 实验

    MTT法用于测量细胞毒性，将指数生长的细胞按每孔1×105个细胞接种入96孔板中培养18h，每组设3个复孔，加入不同浓度ATRA处理48h，弃上清，每孔加入50μl MTT液（1mg/ml）加入各孔中，细胞在 37℃环境下继续培养 4h后加入二甲基亚砜(DMSO)，用微ELISA仪读取每孔570nm吸光度，计算抑制率。细胞抑制率（%）=（对照孔吸光度-实验孔吸光度/对照孔吸光度）×100%。

    1．8  统计学方法

    采用χ2检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  ATRA上调lovo细胞XAF1的mRNA和蛋白表达水平

    为了解结肠癌内XAF1 mRNA表达水平和ATRA诱导对结肠癌细胞XAF1的mRNA表达水平的影响，我们用ATRA处理结肠癌细胞lovo，发现在没有ATRA刺激的情况下lovo细胞内XAFI的mRNA水平很低，经ATRA刺激后XAF1 mRNA的表达增加。随ATRA浓度的增加，XAF1 mRNA的表达量亦增加，ATRA对 mRNA的影响呈剂量依赖性，见图 1。

    图1  RTPCR检测XAF1 mRNA 表达

    Western blot检测显示，lovo细胞未经ATRA处理，XAF1表达一条弱的蛋白阳性带；经ATRA处理48h后，XAF1蛋白的表达有不同程度的增加，阳性带显色强度随药物浓度增加而增强，见图2。

    图2  Western blot检测XAF1蛋白表达

    2.2  ATRA对结肠癌Lovo细胞的抑制作用

    MTT比色法检测结果显示:不同浓度的ATRA对lovo细胞的生长均有抑制作用，与细胞对照组相比均有统计学意义（P<0.05）。随着ATRA剂量的增加，抑制细胞生长的作用越明显。

    2．3  ATRA对XAF1启动子转录活性的影响

    为了解ATRA是否通过增强XAF1基因的转录活性促进XAF1的mRNA表达，将包含XAF1 核心启动子的片段克隆到含荧光素酶报告基因质粒中（pLUC107），转染细胞用16.5μmol/L的ATRA处理，荧光素酶活性检测结果显示，未经ATRA处理的含pluc107的lovo细胞的RLU值为（7±0.5），经ATRA处理后，pluc107活性增加为（19±0.7）。结果提示ATRA通过上调转录活性增加XAF1的表达。

    3  讨论

    已有研究结果显示，XAF1在所有胚胎组织及成人正常组织中广泛表达，但在大多数人类恶性肿瘤细胞中表达水平低下甚至缺失［2，3］。MA等［4］的研究发现，XAF1 mRNA在结肠癌组织中表达降低，存在转录抑制现象。在同一患者体内，恶性肿瘤组织/邻近正常组织XAF1表达的比值显著低于良性肿瘤组织/邻近正常组织。提示XAF1基因可能在结直肠肿瘤中具有良、恶性鉴别作用。XAF1的低表达或不表达还与结直肠肿瘤的分期、分级密切相关［5］；低表达XAF1抑制肿瘤细胞凋亡的发生，过表达XAF1可抑制胃肠肿瘤细胞的增殖，增强肿瘤细胞对依托泊甙和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导凋亡的敏感性［57］。这些研究发现提示XAF1在结直肠肿瘤组织中低表达可能是肿瘤细胞存活和进展的重要机制。

    本研究资料显示，结肠癌细胞lovo表达XAF1低下，给予ATRA诱导后，XAF1的表达在mRNA水平和蛋白水平均可升高，并随着ATRA浓度的增加而增强，具有剂量依赖的效应。MTT实验结果表明，ATRA可抑制lovo细胞生长，且这种抑制作用随ATRA浓度增加而增强，表明ATRA对结肠癌细胞生长有负调控作用。

    维甲酸类化合物是一种常用的诱导分化剂，通过与靶基因上游启动子或增强子的维甲酸反应元件结合而调控一些基因网络的活性，进而影响细胞周期或促进细胞凋亡［8］。为阐明ATRA上调lovo细胞XAF1表达的机制，我们采用荧光素酶报告基因分析XAF1启动子的活性，发现ATRA通过增强XAF1启动子活性上调XAF1的mRNA和蛋白表达水平。尽管许多研究提示XAF1可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，但XAF1抑制肿瘤细胞增殖的机制仍不十分清楚。早期的研究显示，XAF1是通过拮抗XIAP对capase3的抑制作用发挥诱导凋亡作用［6］；最近的研究发现，XAF1还可以通过非XIAP依赖途径诱导细胞的凋亡［9］。而且，通过内源性或外源性诱导XAF1表达能够增强肿瘤细胞对凋亡激发剂如：羟基喜树碱、顺铂、依托泊甙，γ射线等诱导凋亡的敏感性［5］。研究还发现，XAF1是一种新的IFN刺激因子，介导IFN诱导凋亡的作用，并且显著增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肿瘤细胞凋亡［7，10］。本实验结果亦显示，高浓度ATRA能够明显上调XAF1的表达，并显著抑制lovo细胞的增殖。提示XAF1有可能在介导ATRA诱导凋亡的过程中发挥作用，但具体机制仍需进一步研究。

    本研究初步探讨了XAF1基因在ATRA抑制结肠癌细胞增殖中的作用，为进一步阐明XAF1在肿瘤生长过程中的表达调控机制的研究打下了一定的基础。

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