p27mt基因对人大肠癌裸鼠移植瘤模型的影响

作者：陈珺    作者单位：1.442000 湖北十堰,郧阳医学院附属人民医院消化内科;2.附属太和医院妇产科     【摘要】  目的 研究p27mt基因对大肠癌裸鼠移植瘤的生长抑制和抗转移作用及其机制。方法 建立大肠癌裸鼠移植瘤模型，采用瘤体内直接注射法，测量瘤体体积，观察p27mt对移植瘤的生长抑制作用。分离瘤体，制作单细胞悬液，流式细胞术检测细胞周期，测定细胞凋亡。免疫组化检测瘤体组织中MMP9的表达。结果 Adp27mt组、AdLacZ组和对照组移植瘤平均体积分别为（1.94±0.67）cm3、（2.75±0.83）cm3和（3.01±0.76）cm3（P<0.05）；增殖率分别为（37.34±1.45）％、（53.16±3.27）％和（54.48±2.43）％（P<0.05）；凋亡率分别为（19.79±3.32）％，（6.38±4.91）％和（7.25±5.20）％（P<0.01）；MMP9的表达率为20％、75%和66.7％（P<0.01）。结论 人突变p27mt基因通过阻滞移植瘤的增殖, 促进移植瘤细胞的凋亡来抑制移植瘤的生长，通过降低移植瘤MMP9的表达抑制移植瘤的转移。

    【关键词】  大肠癌 p27mt基因 裸鼠 MMP9

    随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，结肠癌发病率在逐渐上升[1]。结肠癌的治疗包括手术、放疗、化疗，但效果均不理想。随着后基因时代的到来，基因的功能成为人们研究的重点，为肿瘤的基因治疗带来了曙光。p27基因是一种抑癌基因，本研究旨在通过动物实验来探讨突变型p27基因对大肠癌的生长及转移方面的作用机制，为p27治疗大肠癌提供依据。

    1   材料与方法

    1.1   细胞株及腺病毒

    Lovo细胞购于武汉大学标准物保藏中心，用RPMI1640培养基培养，调整细胞浓度至1×108/ml,台盼蓝染色活细胞计数>99%。AdLacZ由王家宁博士等构建并惠赠[2]。Adp27mt由本人构建[3]。

    1.2   结肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及分组 购买BALB/C裸鼠36只（湖北省实验动物管表1   各组移植瘤细胞周期分布，PI及凋亡率*：Adp27mt group comparisons with control group and Adp27mt group,P<0.01理中心），鼠龄4～ 6周,体重18～ 25g。取0.2ml结肠癌Lovo细胞悬液，分别在裸鼠右侧背部皮下接种，共36只。成瘤后选用肿瘤大小介于0.5～ 1.5cm之间的裸鼠27只，随机分为对照组，AdLacZ组和Adp27mt组。采用瘤体内直接注射法,每次分别注射PBS 0.1ml, AdLacZ0.1ml (病毒含量1010pfu/ml)和Adp27mt 0.1ml(病毒含量1010pfu/ml)。3日1次，连续28天。

    1.3   移植瘤体积测定

    测定移植瘤的长径（a）和短径（b），按公式V=a2b/2计算体积。

    1.4   流式细胞术

    待裸鼠移植瘤模型治疗28d后，处死裸鼠，分离瘤体、称重、照相。分别切取移植瘤组织15g，制成单细胞悬液，取100μl，加入DNAPREPTMLPR 200μl混匀，室温避光3min后加入DNAPREPstain 1 000μl染色试剂混匀，15min后在Coulter Epics XL流式细胞仪上检测细胞周期及细胞凋亡。细胞增殖指数（PI）按以下公式计算：

    PI=S+G2/MG0/G1+S+G2/M×100%

    1.5   免疫组化检测MMP9的表达

    SP法染色鼠抗人MMP9单克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色剂购自北京中山公司，具体步骤按试剂盒说明书进行。结果判断标准：MMP9为胞质中的棕黄色颗粒。在癌巢周边基质区，计数5个视野，每个视野计数细胞总数及MMP9表达阳性的癌细胞数，根据细胞着色的范围及程度，将免疫组织化学程度分为:-未见阳性染色细胞；+着色淡或着色细胞<10%；++着色适中或着色细胞占10%～ 25%；+++着色深或着色细胞大于50%。-为阴性表达；+/++为弱阳性表达；+++为强阳性表达。

    1.6   统计学方法

    计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验，计数资料用χ2检验。

    2   结果

    2.1   各组移植瘤末次体积比较

    Adp27mt组移植瘤平均体积（1.94±0.67）cm3显著小于对照组移植瘤平均体积（3.01±0.76）cm3（P<0.05）；对照组移植瘤平均体积（3.01±0.76）cm3与AdLacZ组移植瘤平均体积（2.75±0.83）cm3相比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

    图1   移植瘤体积的比较（cm3）

    Fig 1   Comparison of volum among groups in

    transplanted  colorectal  carcinoma（cm3）

    2.2   各组移植瘤细胞周期分布、PI及凋亡率比较

    Adp27mt组移植瘤G0/G1期细胞增多，S期及G2/M期细胞减少，Adp27mt组与其他组比较差异有统计学意义（P<0.05），对照组与AdLacZ组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

    2.3   MMP9在移植瘤中的表达

    MMP9主要在癌巢周边基质区域，着色于癌细胞的胞浆中，呈棕黄色颗粒，见图2。Adp27mt组中MMP9的表达比对照组明显降低，见表2。

    a：control group; b：Adp27mt group

    图2   MMP9在移植瘤中的表达

    Fig 2   Expression of MMP9 in

    transplanted  colorectal  carcinoma

    3   讨论

    p27是一种细胞周期负调控因子，是一种抑癌基因[4]。其表达异常（缺失或减少）时，细胞周期的 # P>0.05: AdLacZ group vs control group；* P<0.05: Adp27mt group vs AdLacZ group and control group抑制作用减弱，将导致细胞生长的失控，发生癌变[5]。Ganoth等[6]和Troncone等[7]研究结果表明：p27表达降低与泛素介导的蛋白酶体磷酸化p27/187位点的苏氨酸降解途径作用异常增强有关。因此，本课题通过瘤体内直接注射187位突变的p27mt基因重组腺病毒，研究其在体（in vivo）对移植瘤的抑制作用。

    Park等[8]发现p27mt(mutant type p27)对肿瘤细胞的抑制作用比p27wt(wild type p27)作用更强，使细胞阻滞于G0/G1期，且有更强的促细胞凋亡作用。Jaen等[9]进一步研究发现p27mt的半衰期超过12h，远超过野生型p27wt的2h。本课题通过测定移植瘤体积，发现p27mt基因对大肠癌的生长有明显的抑制作用，其机制可能是通过抑制细胞的增殖和促细胞凋亡作用。通过细胞增殖指数的测定和凋亡率的检测发现，p27mt可明显抑制细胞的增殖，阻滞细胞于G0/G1期，与对照组比较有明显的促凋亡作用，凋亡率达（37.9±3.32）%。

    本课题前期研究发现大肠癌组织中p27呈低表达，且分化程度越低，表达越低。p27与肿瘤组织的分化程度及淋巴结转移密切相关[10]。本研究通过检测移植瘤组织中的金属蛋白酶9（MMP9）,发现p27mt能降低MMP9的表达。MMP9以酶原形式存在于胞质中，生理情况下释放到细胞外，降解细胞外基质，参与机体的生长发育及组织修复等多种生理过程[11]。当MMP9基因发生紊乱时，酶原生成增多，释放到胞外降解Ⅳ、Ⅴ胶原，层粘连蛋白等成分，破坏基底膜的完整性，在肿瘤的浸润转移过程中扮演着十分重要的角色[12]。本文观察到p27mt降低了MMP9的表达。本文还观察到在移植瘤生长的28天内，未见到肿瘤的转移。p27mt抑制肿瘤转移的机制是降低了MMP9的表达还是有其他机制，我们将进一步探讨。

    综上所述，p27mt通过抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡而抑制大肠癌的生长，并对大肠癌的转移有一定的抑制作用。

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